HPLC-ELSD法测定阿胶补血口服液中黄芪甲苷含量

【摘要】  目的 建立阿胶补血口服液中黄芪甲苷的含量测定方法。方法 采用HPLC-ELSD法,色谱柱：Betasil C18 (4.6 mm×200 mm,5 μm),流动相：甲醇-水(74∶26),流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；ELSD参数：漂移管温度90 ℃,气体流量2.0 L/min。结果 黄芪甲苷在0.43～2.15 μg之间呈良好线性关,回归方程为：Y=1.536 37X+0.921 58, r=0.999 9(n=6)；平均加样回收率97.98%,RSD=1.03%。结论 本方法准确、可靠、重复性好,可作为阿胶补血口服液的质量控制方法。
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【关键词】  HPLC-ELSD；阿胶补血口服液；黄芪甲苷；含量测定

        Abstract：Objective To establish a method for the determination of Astragaloside Ⅳ in Ejiao Buxue Koufuye. Methods HPLC-ELSD was used to determine directly Astragaloside IV in Ejiao Buxue Koufuye on Betasil C18 column, using CH3OH-H2O (74∶26) as a mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min. The temperature of drift tube for ELSD was 90 ℃ and the flow rate of N2 was 2.0 L/min. Results The linear range of Astragaloside Ⅳ was 0.43～2.15 μg, Y=1.536 37X+0.921 58, r=0.999   9 (n=6), the average recovery of the added sample was 98.5% and RSD=0.98%. Conclusion The method is accurate and reliable with a good reproducibility. It can be used for the quality control of Ejiao Buxue Koufuye. 　Key words：HPLC-ELSD；Ejiao Buxue Koufuye；Astragaloside Ⅳ；determination    阿胶补血口服液为中药复方制剂,由黄芪、阿胶、熟地黄、党参、枸杞子、白术组成,具有滋阴补血、补中益气、健脾润肺之功,用于久病体虚、血亏目眩、虚痨咳嗽等症[1]。黄芪为方中主药,现代药理研究表明,黄芪具有增强免疫、抗疲劳、促进代谢等功用,而黄芪的活性成分主要为皂苷类,黄芪甲苷又是其主要活性成分之一。本试验采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法,对阿胶补血口服液中黄芪甲苷的含量进行了研究,建立了方中黄芪甲苷的HPLC-ELSD含量测定方法。

1  仪器与试药

   DIONEX高效液相色谱仪,ASI-100自动进样器,Altech 2000ES型ELSD检测器,Chromeleon色谱工作站；十万分之一电子天平。黄芪甲苷对照品(批号0781-200109,购自中国药品生物制品检定所)；阿胶补血口服液(批号050501、050502、050503,河南省四方药业有限公司生产)。甲醇为色谱纯；水为双蒸水。　　

2  方法与结果

2.1  色谱条件与系统适用性试验  　　Betasil C18色谱柱(4.6 mm×200 mm,5 μm)；流动相为甲醇-水(74∶26)；流量：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；ELSD漂移管温度90 ℃,气体流量2.0 L/min。分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液20 μL注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件测定,记录色谱图,理论塔板数以黄芪甲苷计不低于3 000,黄芪甲苷色谱峰与相邻峰的分离度不低于1.5,阴性对照溶液在黄芪甲苷峰位置处无干扰峰,黄芪甲苷与样品中其他组分色谱峰可完全分离(见图1)。2.2  对照品溶液的制备    精密称取黄芪甲苷对照品10.75 mg,置5 mL量瓶中,加甲醇溶解后稀释至刻度(黄芪甲苷对照品浓度2.15 mg/mL),摇匀,精密量取1 mL,于5 mL量瓶中加甲醇稀释至刻度,作为对照品溶液(黄芪甲苷对照品浓度0.43 mg/mL)。
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　　2.3  供试品溶液的制备

    精密吸取本品10 mL,用正丁醇萃取3次,每次10 mL,合并正丁醇液,加入氨试液2次,每次20 mL,弃去氨试液层,合并正丁醇液层,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解并定容至5 mL,作为供试品溶液。取缺黄芪阴性样品,同供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

　　2.4  线性关系考察
   
　　分别精密吸取对照品溶液1、2、3、4、5 μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件进行测定,以进样量的常用对数为横坐标,峰面积的常用对数为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程：Y=1.536 37X+0.921 58,r=0.999 9(n=6)。结果显示,黄芪甲苷在0.43～2.15 μg之间呈良好线性关系。

　　2.5  精密度试验

    精密吸取黄芪甲苷对照品溶液30 μL,注入液相色谱仪,连续进样5次,测定黄芪甲苷的吸收峰面积,RSD=1.37%(n=5)。

　　2.6  稳定性试验

    精密吸取供试品溶液20 μL,在0、1、2、5、24 h分别注入液相色谱仪,测定黄芪甲苷峰面积,RSD=1.067%(n=5),表明供试品溶液在24 h内稳定。

　　2.7  重现性试验

    取同一批样品(批号050501),重复测定5次,结果平均含量为0.02953 mg/mL,RSD=0.13%。
2.8  加样回收率试验
 
　　 取已知含量的样品(批号050501,0.029 53 mg/mL),量取6份,每份10 mL,分为3组,每组2份,分别精密加入浓度为0.430 mg/mL的黄芪甲苷对照品0.8、1.0、1.2 mL,按上述方法测定其含量,并计算加样回收率,平均回收率为97.98%,RSD=1.03%。结果见表1。 表1  加样回收率试验结果（略）
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　　2.9  样品测定
  
　　分别精密吸取对照品溶液2、5 μL,供试品溶液20 μL,注入液相色谱仪,测定,并以外标两点法对数方程计算含量,结果见表2。表2  样品测定结果(略)

　　3  讨论
  
　　黄芪甲苷含量测定一般采用薄层扫描法[2]、高效液相色谱 -蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)[3]、高效液相色谱-紫外检测器法[4-5]、HPLC-示差折光检测法[6],还有用柱前衍生化高效液相色谱-紫外检测器进行测定[7]。黄芪甲苷无特征紫外吸收,仅在200 nm处有弱的末端吸收,需采用紫外末端波长检测,对溶剂要求较高,测试成本昂贵；且在其它皂苷类成分的存在时,干扰严重,分离度下降,重现性差,很难利用HPLC-UV联用测定黄芪甲苷含量。采用蒸发光散射检测器检测,则克服了上述不利因素,具有专属性强、灵敏度高、不受杂质成分干扰等优点。因此,本实验采用HPLC-ELSD的方法,测定方中黄芪甲苷的含量。

    方法学考察结果表明,HPLC-ELSD联用测定黄芪甲苷含量重现性好,回收率高,方法准确可靠,可用于阿胶补血口服液的质量控制。

【参考文献】
  [1] 国家药典委员会.部颁药品标准中药成方制剂第10册[M].1996.81.

　　[2] 洪丽娟,张均涛,冯年平.薄层扫描法测定黄芪降糖颗粒中黄芪甲苷的含量[J].中成药,2005,27(10)：附4.

　　[3] 裘飞君,王岳钧,俞建平.HPLC-ELSD法测定黄芪生脉饮中黄芪甲苷含量[J].中国药业2005,14(11)：37
　　
　　[4] 李欢欣,郝桂明,赵春杰,等.反相高效液相色谱法测定黄芪中黄芪甲苷的含量[J].中国药学杂志,2003,38(3)：212.

　　[5] 钱广生,刘三康,李章万.HPLC测定黄芪注射液中黄芪甲苷的含量[J].华西药学杂志,2002,17(1)：41.
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　　[6] 池玉梅,郑 泉.HPLC-示差折光检测法测定黄芪中黄芪甲苷的含量[J].中药材,2000,23(7)：397.

　　[7] 姚美村,齐 莹,车镇涛,等.柱前衍生化法测定黄芪中黄芪甲苷的含量[J].天然产物研究与开发,2000,12(4)：172.

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