缬沙坦对扩张型心肌病大鼠炎症因子表达的影响

【摘要】  探讨血管紧张素Ⅱ1型(AT1)受体阻滞剂缬沙坦对扩张型心肌病(DCM)大鼠炎症因子表达的影响及意义。方法： 腹腔注射多柔比星建立SD大鼠DCM模型。随机分为DCM模型组(M组, n=11)、缬沙坦组(V组, n=10)、正常对照组(C组, n=10)，V组予以缬沙坦30 mg·kg-1·d-1，C组和M组予以生理盐水灌胃，8周后行心脏超声和血流动力学检测，放免法检测血清TNF?α，IL?6，IL?1β浓度，测定心室质量及指数，观察心肌病理改变，测定心肌胶原含量(CVF)。结果： 与C组相比，M组左室内径、心室质量及指数显著增加(P<0.05)，心功能显著降低(P<0.05)，血清TNF?α，IL?6，IL?1β浓度和心肌胶原含量显著升高(P<0.05)。缬沙坦可以显著降低DCM大鼠血清TNF?α，IL?6，IL?1β水平和心肌胶原含量(P<0.05)，缩小左室内径、降低心室质量及指数(均P<0.05)，改善心功能(P<0.05)。结论： 缬沙坦可以通过降低DCM炎症因子表达，部分逆转心室重塑，改善心功能。 快速论文发表【关键词】  多柔比星 缬沙坦 扩张型心肌病 细胞因子

    ［Abstract］  Objective: To investigate the changes of inflammatory cytokines in rats with dilated cardiomyopathy(DCM)and whether angiotensinⅡtype1(AT1)receptor blocker, valsartan, has a protective effect by influencing inflammatory cytokines. Methods： Models of DCM were established by adriamycin injected via intraperitonealy in SD rats. Rats were divided randomly into 3 groups as follows: DCM group(group M, n=11), valsartan group(group V, n=10), control group(group C, n=10). Valsartan was administered by daily gavage at a dose of 30 mg·kg-1·d-1 in group V for 8 weeks. Physiological saline was administered in group C and group M. Hemodynamics and echocardiographic measurents were obtained after 8 weeks. Concentration of TNF?α，IL?6，IL?1β in serum was determined by method of radioimmunoassay. ventricle was weighed and weight index was measured. Histopathological characteristics were observed by HE and VG dyeing. Collagen volume fraction(CVF)was calculated.  Results： Compared with group C, the diameter of left Ventricle in group M was significantly extended, which was attenuated in group V(P<0.05); ventricular weight and index were increased in group M and significantly reduced by valsartan treatment(P<0.05); left ventricular contractile fuction in group M is significantly decreased, which was partly nomalized by valsartan(P<0. 05); concentration of TNF?α，IL?6，IL?1β in serum and cardiac collagen volume fraction was significantly increased in group M and attenuated by valsartan treatment(P<0.05). Conclusion： Treatment with valsartan can attenuate ventricular remodeling and partly normalize contractile function by decreasing the expression of TNF?α，IL?6，IL?1β in rats with dilated cardiomyopathy.

    ［Key words］  adriamycin;  valsartan;  dilated cardiomyopathy;  cytokine

    扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)是充血性心力衰竭(CHF)的重要原因之一。近年来，有研究者发现，TNF?α，IL?6，IL?1β等炎症因子与心力衰竭的发生、发展及预后密切相关［1］。本研究旨在观察血管紧张素Ⅱ1型(AT1)受体阻滞剂缬沙坦对DCM心力衰竭大鼠炎症因子表达的影响，探讨AT1受体阻滞剂治疗DCM心力衰竭的新机制。快速论文发表

    1  材料和方法

    1.1  材  料

    1.1.1  实验动物  健康成年雄性SD大鼠，40只，体质量（254±27）g，由江苏大学实验动物中心提供。

    1.1.2  试剂  多柔比星由浙江海正药业股份有限公司生产；氯胺酮由江苏恒瑞医药有限公司生产；缬沙坦由北京诺华制药有限公司馈赠；TNF?α，IL?6，IL?1β放射免疫试剂盒，北京北方生物技术研究所产品；VG染色试剂盒，福州迈新生物技术开发有限公司产品。

    1.1.3  仪器和设备  Agilent Sonos5500彩超仪，美国Agilent公司产品；小动物电生理记录仪，澳大利亚Powerlab公司产品；病理切片机，德国LeicaRM2135；显微照相系统，德国LeicaQWIN3。

    1.2  方  法

    1.2.1  实验模型制备及动物分组  40只SD大鼠随机分为正常对照组(C组, n=10)，造模组30只。造模组用溶于生理盐水的多柔比星，浓度为2 mg·ml-1，剂量2 mg·kg-1·w-1，腹腔内注射，共8周，即多柔比星总累计量为16 mg·kg-1；正常对照组予以同体积生理盐水腹腔注射。正常对照组全部存活，造模组存活21只，对造模组进行心脏彩超的检测，证实大鼠扩张型心肌病模型复制成功，分为DCM模型组(M组, n=11)、缬沙坦组(V组, n=10)。V组予以缬沙坦30 mg·kg-1·d-1，C组、M组予以生理盐水，灌胃，8周后行相关检测。

    1.2.2  心脏超声检测  探头采用S12型，频率为5～12MHz。氯胺酮(100 mg·kg-1)腹腔注射全身麻醉大鼠，8%Na2S脱毛，取左室短轴切面，在二维影像指导下测量左室舒张末内径(LVEDD)，左室收缩末内径(LVESD)，左室射血分数(LVEF)，左室短轴缩短率(LVFS)。所有指标均在3个连续的心动周期中由2个观察者分别观测取平均值。

    1.2.3  血流动力学检测  氯胺酮(100 mg·kg-1)腹腔注射将大鼠全身麻醉，颈部正中切口，分离出右颈总动脉，将软质导管自右颈总动脉插入左心室，尾部连接生理记录仪的压力传感器，记录分析左心室压峰值(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室最大压力上升及下降速度(±dp/dtmax)。

    1.2.4  血清TNF?α，IL?6，IL?1β检测  颈动脉取血8 ml，离心，取1 ml血清，加入10 μl抑肽酶，摇匀，-20℃保存，测定TNF?α；余血清-20℃保存，测定IL?1β，IL?6。操作按放免试剂盒测定步骤。

    1.2.5  心室质量及指数的测定  待血流动力学检测、取血完成后开胸，取出心脏，以冰肝素生理盐水冲洗，分别称取左心室(含室间隔)实际质量(left ventricular actual weight, LVAW)和右心室实际质量(right ventricular actual weight, RVAW)，除以体质量(body weight)，得到左室质量指数(left ventricular weight index, LVWI)和右室质量指数(right ventricular weight index, RVWI)。

    1.2.6  组织病理学检查和心肌胶原分析  将左心室放至10%中性甲醛液固定，剪取中段2～3 mm厚，常规石蜡包埋、切片、HE和VG染色，显微镜下观察。VG染色后，用计算机图文分析系统在400倍下行图像处理，每张切片选取5个不相互重叠的视野，计算每个视野中胶原组织所占百分比，心肌胶原容积百分比=胶原面积/全视野面积×100%，取平均数代表胶原容积百分比(CVF)。

    1.2.7  统计分析  实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用SNK法，P<0.05为差异有统计学意义。全部资料用SPSS13.0统计软件进行统计处理。快速论文发表

    2  结  果

    2.1  一般情况

    正常对照组、DCM模型组、缬沙坦组仍存活大鼠分别为10，6和8只。缬沙坦组死亡率（20%）显著低于DCM模型组(45%），P<0.05，主要死亡原因为心力衰竭。

    2.2  心脏超声测定结果

    与正常对照组相比，DCM模型组LVEDD，LVESD显著增大(P<0.05)，LVFS，LVEF显著降低(P<0.05)；与DCM模型组相比，缬沙坦组LVEDD，LVESD明显减小(P<0.05)，LVFS，LVEF显著上升(P<0.05)。见表1。

    2.3  血流动力学结果

    与正常对照组相比，DCM模型组LVSP，+dP/dtmax，-dP/dtmax显著降低(P<0.05)，LVEDP显著升高(P<0.05)；与DCM模型组相比，缬沙坦组LVSP，+dP/dtmax，-dP/dtmax均明显升高(P<0.05)，LVEDP明显降低(P<0.05)。见表1。

    2.4  心室质量及指数

    DCM模型组左右心室质量及指数均显著大于正常对照组(P<0.05)；缬沙坦组左右心室质量及指数显著低于DCM模型组(P<0.05)。见表2。

    2.5  血清TNF?α、IL?6，IL?1β浓度

    DCM模型组血清TNF?α，IL?6，IL?1β水平显著高于正常对照组(P<0.05)。缬沙坦组明显低于DCM模型组(P<0.05)。见表3。 表1  各组大鼠超声心动图和血流动力学检测结果 表2  各组大鼠心室质量及指数检测结果表3  各组大鼠血清炎症因子浓度测定结果

    2.6  组织病理学检查和心肌胶原分析

    大鼠心肌HE染色显示：正常对照组心肌细胞形态正常；DCM模型组呈现灶状变性坏死，心肌细胞明显肿胀，心肌纤维局限性断裂，心内膜中胶原和弹性纤维增生，局灶性心肌纤维被纤维组织所替代，部分心肌细胞肌浆凝聚、细胞核固缩、变形或消失、脂肪变性，胞质内有空泡形成及淋巴细胞的浸润和成纤维细胞的增生；缬沙坦组上述变化明显减轻，见图1。大鼠心肌VG染色光镜下可见，正常对照组仅见少许胶原，DCM模型组可见胶原大量增生，缬沙坦组胶原增生明显轻于DCM模型组，见图2(图中正常心肌组织呈黄色，红色示胶原增生，将心肌细胞分隔成网筛状）。胶原容积百分比，DCM模型组显著高于正常对照组(P<0.05)，缬沙坦组显著低于DCM模型组(P<0.05)。见图3。快速论文发表

    3  讨  论

    心力衰竭时，机体处于免疫激活状态，TNF?α，IL?6，IL?1β等炎症因子水平显著上升［2］。TNF?α，IL?6，IL?1β可以通过直接降低心肌收缩功能、促进心肌细胞增生肥厚、进行性凋亡，导致心肌重塑；还可以促进氧化应激，降低心肌抗氧化能力［3］；TNF?α，IL?1β可以上调和活化基质金属蛋白酶（MMPs）［4，5］，激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)［6］，促进胶原沉积和心肌间质纤维化；TNF?α还可以通过直接上调AT1受体基因表达，增强血管紧张素2介导的促纤维化作用，上调转化生长因子（TGF），刺激胶原合成；在DCM中，TNF?α还可以由衰竭的心肌细胞分泌，TNF?α水平和左室舒张末容积具有明显相关性［7］。

    DCM主要表现为心室扩大和收缩功能减退，最终出现致命性充血性心力衰竭。多柔比星具有心脏毒性作用，小剂量向大鼠腹腔注射多柔比星可以成功建立DCM动物模型，并且接近人类DCM病理生理过程［8］。

    本研究结果显示，多柔比星诱导的DCM大鼠血清TNF?α，IL?6，IL?1β水平显著上升，左室内径，心室质量及指数明显增大，心肌胶原含量升高，心功能下降，提示DCM心力衰竭与TNF?α，IL?6，IL?1β过度表达有关。而在缬沙坦干预DCM后，可以明显降低血清TNF?α，IL?6，IL?1β水平，缩小DCM大鼠左室内径、降低心室质量及指数，降低心肌胶原含量，改善心功能。

    缬沙坦作为一种血管紧张素Ⅱ1型受体阻滞剂，主要通过与AT1受体结合，竞争性抑制血管紧张素Ⅱ的生物学效应而发挥作用。其可能的机制为：①抑制AT1受体介导的血管紧张素Ⅱ的缩血管作用，减轻心脏的前后负荷，降低左室舒张末压，改善心脏舒缩功能。②阻断心力衰竭时被激活的肾素-血管紧张素系统，从而抑制增加心肌耗氧量、收缩外周血管的儿茶酚胺类物质的过度释放。③纠正心肌钙调蛋白和钙运转的紊乱，减轻心肌细胞内钙超载，恢复钙介导的兴奋-收缩偶联［9］。④有效抑制TNF?α，IL?6，IL?1β等炎症因子的表达，缓解因炎症因子引发的心肌细胞凋亡、胶原沉积和纤维化，逆转心室重构。

    综上所述，炎症因子TNF?α，IL?6，IL?1β的过度释放可能是DCM心力衰竭的机制之一。长期应用AT1受体拮抗剂缬沙坦能有效地改善DCM的心脏舒缩功能，部分逆转心室重塑，其机制可能与其抑制炎症因子TNF?α，IL?6，IL?1β表达有关。快速论文发表

【参考文献】
  ［1］ Mann DL. Inflammatory mediators and the failing heart: past, present, and the foreseeable future［J］. Circ Res, 2002, 91(11):988-998.

［2］ Rivera M, Taléns?Visconti R, Jordán A, et al. Myocardial remodeling and immunologic activation in patients with heart failure［J］. Rev Esp Cardiol, 2006, 59(9):911-918.

［3］ Haudek SB, Taffet GE, Schneider MD, et al. TNF provokes cardiomyocyte apoptosis and cardiac remodeling through activation of multiple cell death pathways［J］. J Clin Invest, 2007, 117(9):2692-2701.

［4］ Brown RD, Jones GM, Laird RE, et al. Cytokines regulate matrix metalloproteinases and migration in cardiac fibroblasts［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 362(1):200-205.

［5］ Matsusaka H, Ikeuchi M, Matsushima S, et al. Selective disruption of MMP?2 gene exacerbates myocardial inflammation and dysfunction in mice with cytokine?induced cardiomyopathy［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2005, 289(5):1858-1864.

［6］ Mitchell MD, Laird RE, Brown RD, et al. IL?1beta stimulates rat cardiac fibroblast migration via MAP kinase pathways［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 292(2):1139-1147.

［7］ Tsutamoto T, Wada A, Ohnishi M, et al. Transcardiac increase in tumor necrosis factor?alpha and left ventricular end?diastolic volume in patients with dilated cardiomyopathy［J］. Eur J Heart Fail, 2004, 6(2):173-180.

［8］ 白 洁，盛 佳，陈 蓉，等. SD大鼠扩张型心肌病模型的建立［J］. 江苏大学学报：医学版，2006, 16(3):210-212.

［9］ Shao Q, Ren B, Saini HK, et al. Sarcoplasmic reticulum Ca2+ transport and gene expression in congestive heart failure are modified by imidapril treatment［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2005, 288(4):1674-1682.快速论文发表