Y?盒结合蛋白1对白血病K562细胞多药耐药基因?1表达的调控

【摘要】  观察多柔比星诱导K562细胞多药耐药基因?1（mdr1）基因表达过程中Y?盒结合蛋白1（YB?1）表达和核易位的变化情况，初步探讨YB?1蛋白对mdr1基因的转录调控。方法： 多柔比星间歇性长期作用于K562细胞，剂量逐渐增加。RT?PCR检测mdr1，YB?1基因表达，流式细胞仪检测mdr1基因编码的P糖蛋白（P?gp）表达，蛋白质印迹检测YB?1蛋白核易位。通过RNA干扰技术使K562细胞中YB?1基因表达沉默，多柔比星处理YB?1基因沉默细胞，RT?PCR、流式细胞仪分别检测mdr1 mRNA和P?gp的表达。结果： 经多柔比星作用后K562细胞mdr1基因转录上调，P?gp表达增加，同时YB?1基因转录也增强，且出现明显的核易位。YB?1基因沉默后，mdr1基因诱导性表达减少。结论： 多柔比星诱导K562细胞mdr1基因表达的过程中，YB?1对于mdr1基因的转录活化起一定的作用。 快速论文发表

【关键词】  Y?盒结合蛋白1 多药耐药基因?1 多药耐药 转录调节

    ［Abstract］  Objective: To investigate the effect of  YB?1 on the transcription of mdr1 gene.Methods： K562 cells were treated with doxorubicin (DOX)at different concentrations and times.Expression of mdr1 and YB?1 genes were examined by reverse transcription?polymerase chain reaction (RT?PCR).P?glycoprotein (P?gp)was detected by flow cytometry.Cyto/nuclear protein was extracted for Western blotting to detect YB?1.To inhibit the expression of YB?1 gene in K562 cell using RNA interference (RNAi)targeting YB?1 gene, then detect the expression of mdr1 and    P?gp in YB?1 gene silenced cells after treated with DOX. Results： When K562 cells were exposured to DOX, the mdr1 gene was highly expressed as well as its corresponding protein P?gp.Further, DOX up?regulated the expression of YB?1 gene, and promoted YB?1 protein translocate to nucleus.Another, when YB?1 gene was silenced, the expression of mdr1 gene and P?gp were obviously decreased in K562 cells treated with DOX. Conclusion： Doxorubicin could induce the expression of mdr1 gene in K562 cells, it may be due to YB?1 activating the transcription of mdr1 gene.

    ［Key words］  YB?1;  mdr1;  multidrug resistance;  transcriptional regulation

    多药耐药（MDR）是白血病化疗失败和复发的主要原因，多药耐药基因?1(mdr1)及其编码的蛋白P?糖蛋白（P?glycoprotein, P?gp）是导致耐药产生的最主要原因。mdr1基因转录调控机制比较复杂, 多种转录因子和阻遏蛋白参与了mdr1基因的表达调控。Y?盒结合蛋白1 (Y?box binding protein?1, YB?1)是Y?盒蛋白家族成员之一，其结构中高度保守的冷休克区（cold shock domain, CSD）可识别多种基因启动子区的反向CCAAT盒，即Y?盒，并与之特异性地结合。mdr1基因启动子区域含有CCAAT序列，有关白血病中YB?1调控mdr1基因表达的研究报道尚较少见，我们通过多柔比星诱导K562细胞耐药来研究YB?1对mdr1基因诱导性表达的影响，初步探讨其意义。快速论文发表

    1  材料与方法

    1.1  主要材料

    人慢性粒红白血病急性变K562细胞系为我室传代培养；RPMI1640为美国Gibco Bal公司产品；RT?PCR所用反转录酶和Taq酶等试剂均购自MBI公司；PE标记的P?gp抗体为美国BD公司产品；3种携带YB?1基因的特异性短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)的真核表达载体及随机片段载体由本实验室保存，分别为pGenesil?1/YBX11，pGenesil?1/YBX12，pGenesil?1/YBX13和对照质粒pGenesil?1/HK；LipofectamineTM 2000脂质体购于Invitrogen 公司；YB?1多克隆抗体购自abCAM公司；采用Bivision公司Nuclear/cytosol Fractionation Kit提取胞质、胞核蛋白。

    1.2  细胞培养

    K562细胞在37℃，5% CO2条件下悬浮培养于RPMI1640液中，后者含有10%小牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺和100 U/ml青、链霉素。取2×105/ml K562细胞接种，以0.01 μg/ml多柔比星为起始浓度诱导耐药，培养24 h后撤药换新鲜无多柔比星的完全培养基培养，直至细胞状态恢复，重新接种（细胞密度2×105/ml），加入多柔比星（终浓度为0.02 μg/ml）继续诱导耐药。依上述方法，多柔比星浓度依次递增，直至0.05 μg/ml。取多柔比星浓度为0.01，0.03和0.05 μg/ml的细胞为实验组，分别记为K562（0.01），K562（0.03），K562（0.05）， K562细胞为阴性对照组。

    1.3  mdr1，YB?1基因的检测

    采用半定量反转录聚合酶链反应（RT?PCR）法。取4组细胞各1×106，应用Trizol体系提取RNA，反转录合成cDNA，-20℃保存。mdr1，YB?1和β?actin引物由上海生物工程公司合成，引物序列：mdr1， P1：5′?GTTGCCATTGACTGAAAGAAC?3′，P2：5′?ACAGGAGATAGGCTGGTTTGA?3′；YB?1， P1：5′?ACCACAGTATTCCAACCCTCCTG?3′，P2：5′?ATCTTCTTCATTGCCGTCCTCTC?3′；β?actin，P1:5′?CTCG?CGCTACTCTCTCTTTC?3′，P2：5′?CATGTCTCGATCCCACTTAAC?3′。反应条件：94℃ 5 min，95℃ 30 s，58℃（YB?1）/56℃（mdr1） 30 s，72℃ 30 s，30个循环后72℃延伸5 min。扩增产物：mdr1为173 bp，YB?1为190 bp，β?actin为330 bp。1.2%琼脂糖凝胶（含EB终浓度为0.5  μg/ml）电泳，凝胶成像仪扫描并定量，以β?actin为内参照进行质控和标化。

    1.4  P?gp的检测

    流式细胞仪检测多柔比星诱导耐药前后细胞膜表面P?gp表达情况。取4组细胞各2×105，用4℃预冷PBS洗涤2次，加入PBS制成单细胞悬液，加入PE标记的抗人P?gp单克隆抗体，常温避光孵育15 min，洗涤细胞后上流式细胞仪检测。

    1.5  YB?1蛋白的检测

    采用蛋白质印迹法检测YB?1蛋白表达的改变情况。取4组细胞各1×107，参照Nuclear/cytosol Fractionation Kit说明书提取胞质和胞核蛋白，Bradford法蛋白定量，SDS?PAGE电泳，4℃，90 mA稳流过夜转膜，进行免疫反应后于Typhoon 9400 Variable Mode Imager扫描并定量。胞质、胞核蛋白分别以GAPDH，Histon 1为内参照进行质控和标化。

    1.6  基因转染及阳性细胞克隆的筛选

    采用LipofectamineTM2000 脂质体转染法转染，操作流程按照说明书进行。转染48 h后换含G418 600 mg/L的完全培养液抗性筛选2周，K562组细胞全部死亡，转染pGenesil?1/YBX11，pGenesil?1/YBX12，pGenesil?1/YBX13和对照质粒pGenesil?1/HK的细胞均有抗性细胞生长，分别命名为K562/Y1，K562/Y2，K562/Y3和K562/HK。

    1.7  流式细胞仪检测shRNA转染率

    取5组细胞K562，K562/HK，K562/Y1，K562/Y2 和K562/Y3各5×105，PBS洗2次，制成单细胞悬液，上样于流式细胞仪。pGenesil?1真核表达载体带有绿荧光蛋白基因,可参照检测异硫氰酸荧光素(FITC)的常规方法，经流式细胞仪检测分析5 000～10 000个细胞的相对荧光强度(RFI)和荧光表达率(其激发波长475 nm，发射波长490 nm)。

    1.8   统计学分析

    计量资料以均数±标准差(±s)表示，应用SPSS11.0统计软件对数据进行分析，采用单因素方差分析和两样本均数t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。快速论文发表

    2  结  果

    2.1  多柔比星诱导mdr1基因表达

    2.1.1  mdr1基因转录上调  反转录聚合酶链反应结果显示K562细胞无明显mdr1基因表达，经多柔比星作用后，K562细胞逐渐表达mdr1基因，并呈剂量依赖性。0.03和0.05 μg/ml多柔比星均能诱导mdr1基因表达，而0.01 μg/ml多柔比星无明显作用(图1，表1)。

    2.1.2  P?gp表达增强  P?gp为mdr1基因编码产物，是一种跨膜蛋白。流式细胞仪检测可见K562（0.03）、K562（0.05）的峰值较K562明显右移，平均荧光强度增强，而K562（0.01）与K562比较差异无统计学意义（表2）。随着多柔比星浓度的增加P?gp表达逐渐增加，与mdr1基因表达情况相一致。

    2.2  诱导耐药过程中YB?1的相关检测

    2.2.1  YB?1基因表达上调  RT?PCR结果显示K562细胞YB?1基因呈阳性表达，多柔比星浓度为0，0.01，0.03和0.05 μg/ml时，K562细胞中YB?1基因经β?actin标化后的灰度值分别为0.424±0.053，0.627±0.041，0.826±0.090和1.178±0.102。随着多柔比星作用浓度的增加，YB?1基因表达增强，并呈剂量依赖性（图2）。表2  不同浓度多柔比星作用后K562，K562/HK

    2.2.2  胞质和胞核内YB?1蛋白均增加  蛋白质印迹检测显示K562（0.01），K562（0.03），K562（0.05）3组细胞胞质和胞核YB?1蛋白表达均高于K562组。并且，随多柔比星作用浓度的增加，YB?1表达也渐增，且核易位增多（图3，表3）。表3  多柔比星作用后K562细胞YB?1蛋白表达情况的变化

    2.3  YB?1核易位与K562耐药形成的相关性

    相关性分析显示：YB?1核易位与mdr1基因的转录（r=0.979，P<0.01），P?gp的表达(r=0.956，P<0.01)均呈正相关。

    2.4  YB?1基因干扰的检测

    2.4.1  重组质粒基因转染率  利用脂质体介导的方法将携带有YB?1基因shRNA的真核细胞表达载体转染进K562细胞，G418筛选2周后获得阳性克隆，流式细胞仪检测显示阳性转染组和随机片段转染组平均荧光强度均明显高于未转染的K562细胞（图4）。K562/HK，K562/Y1，K562/Y2，K562/Y3 四组细胞转染率依次为（73.48±1.19)%，（52.46±1.23）%，(62.67±1.16)%和(57.25±1.31)%。

    2.4.2  转染前后YB?1 mRNA的变化  RT?PCR检测5组细胞的YB?1基因的表达，结果显示K562/HK与K562无明显差异，K562/Y2较K562略有降低，K562/Y1和K562/Y3两组细胞YB?1基因表达明显低于K562，尤其以K562/Y3最低（图5）。5组细胞以β?actin标化后的YB?1基因灰度值分别为0.2613±0.026，0.2395±0.011，0.1523±0.016，0.2233±0.029和0.0866±0.015；YBX11，YBX12和YBX13对YB?1 mRNA的抑制率分别为(41.0±0.01)%，(13.3±0.12)%和(65.7±0.09)%。

    2.4.3  转染前后YB?1蛋白的变化  蛋白质印迹结果显示，K562/HK与K562无明显差异，K562/Y2较K562略有降低，K562/Y1和K562/Y3两组细胞YB?1蛋白均明显减少，条带变细（图6）。5组细胞以GAPDH标化后的YB?1灰度值分别为：1.1697±0.100，0.8622±0.620，0.6481±0.098，0.3947±0.156和0.2132±0.110。K562/Y1，K562/Y2，和K562/Y3三组细胞YB?1蛋白分别减少（59.0±0.25）%，（33.6±0.17）%和（66.0±0.13）%。因此，通过RNA干扰的方法，能有效减少YB?1基因表达，3种shRNA中以pGenesil?1/YBX13的抑制率最高，我们选择K562/Y3进行后续多柔比星诱导实验。

    2.5  多柔比星诱导K562/Y3细胞mdr1基因表达

    2.5.1  mdr1基因转录的变化  以K562/HK细胞为对照，排除真核表达载体转染的干扰。RT?PCR结果显示多柔比星作用后K562/HK细胞mdr1基因表达与K562无明显差异，随着多柔比星浓度的增加表达增强，说明真核表达载体转染本身不影响mdr1基因的转录。但K562/Y3细胞mdr1基因表达明显减少，与K562细胞相比分别降低(53.7±0.06)%（多柔比星0.03 μg/ml）,（64.3±0.02）﹪(多柔比星0.05 μg/ml)(图1,表1）。

    2.5.2  P?gp表达的变化  流式细胞仪检测显示多柔比星作用后K562/HK细胞P?gp表达的变化与K562细胞无明显差异，随着多柔比星浓度的增加表达增强，但K562/Y3细胞P?gp表达明显减少（表2）。快速论文发表

    3  讨  论

    YB?1基因定位于染色体1p34,编码的蛋白主要含有3个区域：1个可变的氨基末端，1个高度保守的核酸结合区（CSD），以及羧基末端。CSD区和羧基末端参与了YB?1蛋白与Y盒（反向CCAAT序列）的结合。YB?1蛋白最早是由Didier等［1］在MHCII类抗原中发现并分离出来，广泛地分布于原核与真核生物细胞中。真核生物的YB?1蛋白参与多种生物过程，包括DNA修复，细胞增殖，细胞周期，耐药及基因的转录转译调节。

    Ohga等［2,3］发现YB?1可以与mdr1基因启动子区的反向CCAAT序列相结合，促使mdr1基因转录。转染反义核酸抑制YB?1表达，能明显逆转化疗药物所诱导的mdr1基因活化。通常YB?1位于胞质中，抗癌药、紫外照射、高热等多种刺激因素均能促使其向胞核易位，从而活化其下游基因。羧基末端对于YB?1核易位起重要的作用［4］。乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤等多种实体肿瘤的免疫组化研究显示YB?1的核定位与P?gp高表达有关［5-8］。在乳腺癌细胞中，YB?1的表达量和活化状态与化疗的疗效及预后呈负相关［9,10］。用紫杉醇处理乳腺癌细胞株MCF?7后，EMSA检测显示YB?1蛋白与mdr1基因启动子区域结合增强［11］。我们的研究首次以白血病K562细胞为模型，研究YB?1对血液系统肿瘤多药耐药的影响。结果显示多柔比星作用于K562细胞后mdr1基因转录上调，其编码蛋白P?gp表达明显增加。在mdr1基因诱导性表达的过程中，YB?1基因转录也增加，蛋白表达上升，且胞核内蛋白量也增加，并且YB?1核易位与mdr1的基因转录，P?gp表达呈正相关。通过RNA干扰使YB?1基因表达沉默，多柔比星诱导mdr1基因表达的作用明显减弱，mdr1基因转录下调60%左右，P?gp表达下调40%左右。提示多柔比星能促进YB?1核易位，从而调控mdr1基因的表达。因此YB?1对于白血病K562细胞中mdr1基因的诱导性表达起重要作用，减少YB?1蛋白表达和核易位可以有效抑制mdr1基因表达。

    然而，mdr1基因转录调控机制比较复杂，其启动子区域含有多个正负调控元件，除CCAAT盒外，尚包括AP1位点，GC丰富区，p53结合域及NF?R1结合域等［12］，因此多种转录因子和阻遏蛋白参与了mdr1基因的表达调控。我们的研究结果显示YB?1基因沉默并不能完全抑制多柔比星诱导mdr1基因表达，YB?1是否与其他转录因子相互作用，mdr1基因转录调控的具体机制尚有待于进一步研究。快速论文发表

【参考文献】
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