TGF?β1基因转染对人晶状体上皮细胞周期调控的影响
热度0票 浏览74次
时间：2011年3月05日 11:16
【摘要】 目的：探讨脂质体介导的TGF?β１基因（pEGFP?TGF?β１）转染诱导人晶状体上皮细胞系?B3(HLEC?B3)细胞周期蛋白激酶抑制因子 p21及细胞周期蛋白激酶CDK2的表达及其对细胞周期调控的影响。方法：将pEGFP?TGF?β１转染人晶状体上皮细胞系?B3(HLEC? B3)，采用RT?PCR和Western?blot方法检测pEGFP?TGF?β１转染后24，48，72，96h p21，CDK2和 Smad4 mRNA和蛋白的表达，设立正常细胞组及pEGFP?C2转染组为对照组。结果：pEGFP?TGF?β1转染组TGF?β1 24h开始升高，48h达到最高，72h略有减少，96h明显减少，但仍高于正常组，而空载体组与正常细胞组则无明显变化。p21变化趋势和TGF?β1 相符，CDK2组变化趋势则正好相反，Smad4组48h明显升高，72h下降明显，96h基本恢复正常。结论:TGF?β1通过活化凋亡基因p21，降低细胞周期蛋白激酶CDK2。体育论文发表
【关键词】 晶状体上皮细胞；TGF?β1基因；转染；p21;CDK2;Smad4
Abstract?AIM: To investigate the change of p21,CDK2 and Smad4 on the HLEC transfected with pEGFP?TGF?β1 plasmid and the effect of TGF?β１gene transfection on the cell cycle control of human lens epithelial cell. METHODS:Immortalized human lens epithelial cellline(HLEC? B3) was transfered by pEGFP?TGF?β1 gene. The expression of TGF?β1mRNA,p21mRNA,CDK2mRNA and Smad4 mRNA and protein induced by transfered by TGF?β1 gene were measured by RT?PCR and Western? blot at different time periods .RESULTS: RT?PCR detected that TGF?β1mRNA began to raise after 24h, culminated after 48h ,decreased after 72h,decreased much after 96h,but still more than the normal. p21mRNA companied with it. but CDK2 decreased with it. Western?blot detected that the consequence consisted with RT?PCR.The effect of TGF?β1 gene was demonstrated from the lever of transcription and translation.Smad4 protein raised with the lever of TGF?β1 gene at various time point, but disappeared very quickly.CONCLUSION:TGF?β1 can increase p21,but decrease CDK2,to impact the cell cycle of HLEC. TGF?β/Smad4 pathway take part in the course.
KEYWORDS:lens epithelial cells; TGF?β1; genes transfer; p21;CDK2 ；Smad4
0 引言
转化生长因子?β(TGF?β)可抑制上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞,以及某些肿瘤细胞的生长,并使这些细胞停滞在细胞周期的第一个间隔区：G1期，从而阻止细胞进入S期[1]。许多研究表明，高表达活性 TGF?β1的转基因鼠和其体外培养鼠晶状体均出现晶状体混浊的症状[2,3]，我们的前期实验证明TGF?β1可抑制晶状体上皮细胞增殖，改变细胞周期，诱导其发生凋亡。目前已经发现TGF?β信号传导经典途径为: TGF?β配体与细胞膜受体结合,激活细胞内Smads蛋白,协同多种转录因子,最终导致目的基因表达。Smads类蛋白是TGF?β信号转导通路中必不可少的中介蛋白，存在于胞质中[4]。Smad4是通用枢纽分子,与上游分子形成核转运复合物后,将信号由胞质传入核内,协同转录因子上调或下调靶基因的表达。Smad4由于其中枢作用而被认为是调控TGF?β信号通路的关键分子。我们通过基因转染技术对TGF?β1抑制人晶状体上皮细胞，导致白内障发生的具体作用机制进行探讨。
1 材料和方法
体育论文发表
1.1 材料
永生化细胞系HLEC?B3(中国医科大学眼科),HG?DMEM培养液（美国Highclone公司）,胎牛血清（杭州四季青生物公司）, pSNAV?TGF?β1，pEGFP?C2质粒（北京本元正阳基因技术有限公司），Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）, Trizol试剂盒（GIBCO/BRL公司）; RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0（大连宝生物工程公司）;蛋白质免疫印迹化学发光试剂盒（德国Borhringer Mannheim公司）;鼠抗人CDK2及p21（NEB公司）;生物素标记的蛋白质标准样品,抗生物素标记的蛋白质标准二抗（美国NEB公司）。复苏时将冻存细胞系HLEC ? B3从液氮罐中取出,快速放入37℃温水中溶解,溶化后以1200r/min离心约3～5min,离心半径为15cm。弃培养液后，放入含150mL/L 胎牛血清、100mg/Ｌ青霉素及125mg/Ｌ链霉素的HG?DMEM培养基中,置于50mL/L CO2，37℃的细胞培养箱内培养。EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pSNAV?TGF?β1,回收插入片断（1.8kb），EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pEGFP?C2,回收线性载体(4.7kb)，连接上述二种回收的DNA，转化,筛选克隆，构建后的质粒命名为pEGFP? TGF?β1。
1.2 方法
转染前1ｄ将细胞接种至6孔板,细胞度为1×108个/Ｌ,在50mL/L CO2，37℃饱和湿度下培养24h,90%细胞达到融合;转染前使用PBS缓冲液冲洗细胞1次,更换不含抗生素的培养液。无血清 HG?DMEM250μL稀释pEGFP? TGF?β14μg，温和摇匀。使用前轻轻混匀Lipofectamine2000，然后将Lipofectamine 2000 10μL加入无血清的HG?DMEM 250μL，混匀并于室温温育5min。混合稀释的质粒和Lipofectamine 2000混匀，室温下放置20min。将质粒/Lipofectamine 2000复合物加入到6孔板的孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在50mL/L CO2，37℃饱和湿度下培养，6h后更换含150mL/L胎牛血清的HG?DMEM培养基。将转染细胞,每日在倒置显微镜下观察并记录细胞的形态变化。实验分为pEGFP?TGF?β1转染 24，48，72，96h组；pEGFP?C2转染24，48，72，96h组；正常细胞对照组。提取总RNA,按照Trizol试剂盒说明书进行，参照 Genebank的cDNA序列，用Primer Premier 5软件设计引物:TGF?β1:5? CTGTGGCTACTGGTGCTGAC 3?;5?CATAG ATTTCGTTGTGGGTTTC 3?；p21:5?CCCGTGAGCGATGGAA CT3?;5?CGAGGCACAAGGGTACAAGA3?;CDK2：5?CCGCCT GGACACTGAGACT3?;5?GAGGAGGACCCGATGAGA3?;Smad 4：5?CTGCCAACTTTCCCAACAT 3?;5?AGAAGGGTCCACGT ATCCA 3?;PCR反应按下列组成配制PCR反应液：5×Pcr buffer10μL、灭菌蒸馏水28.75μL,TaKaRa Ex Taq?HS 0.25μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL，将PCR反应液加入到反转录反应结束后的PCR反应管中按下列条件进行PCR反应：94℃预变性 2min，94℃变性30s，50℃～65℃退火30s，72℃延伸0.5～4min，变性至延伸进行30个循环，反应结束后，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。实验重复3离心次。另实验分组同RT?PCR，终止培养后,用冰冷的0.02mol/L PBS冲洗细胞3次,置于冰盒上,用细胞刮取器刮下细胞,置于Eppendorf管内,加入裂解液(2mmol/L/EDTA,10mmol/L /EGTA,20mmol/L/Tris?HCL, pH7.5,2mmol/L MmPMSF, 0.25mol/L蔗糖) 300μL超声粉碎,4℃离心,17500r/min离心2h,将其标准化,将蛋白液样品用120g/LSDS?PAGE分离而后电转移至硝酸纤维膜上, 含50g/L牛血清白蛋白的TTBS封闭1h,加上特异性一抗(1∶400)4℃过夜,TBS洗4次,10min/次,加入碱性磷酸酶(1B2000)，室温孵育2h,加入B?Naphthylacidphosphate和o?dignisidinetetrazotized显色,膜经Kodak1D型凝胶自动成像扫描分析,记录吸光度,实验重复3次。
2 结果
体育论文发表
2.1 TGF?β1，p21，CDK2，Smad4mRNA表达
TGF?β1目的片断319bp，p21目的片断351bp，CDK2目的片断271bp，Smad4目的片断440bp。 pEGFP?TGF?β1转染组TGF?β1 24h开始升高，48h达到最高，72h略有减少，96h明显减少，但仍高于正常组，而空载体组与正常细胞组则无明显变化。p21变化趋势和TGF?β1 相符，CDK2组变化趋势则正好相反，Smad4组48h明显升高，72h下降明显，96h基本恢复正常(图1A?D)。
2.2 Western?blot检测TGF?β1，p21，CDK2，Smad4蛋白的表达Western?blot检测结果和RT?PCR基本相符（图2AD）。
3 讨论
细胞周期调控的研究是近年来细胞生物学研究的热点之一,其核心机制为细胞周期蛋白激酶(cyclin dependent kinase，CDK)的活性表达与调控。CDK的激活是依赖于其调节亚基与胞周期蛋白(cyclin)结合形成复合物而发生作用的。而细胞周期蛋白激酶抑制因子(cyclin dependent kinase,CKI)是一组抑制CDK活性的活性因子,这也是CDK活性调节的另一方式[3，4]。在细胞周期调控的过程中,cyclin与CDK结合形成复合物,推动细胞周期的进程,即形成细胞周期的动力系统。不同类型的cyclin/CDK复合物分别调控细胞周期中细胞生长、DNA复制及细胞分裂等重要过程。CKI通过与cyclin/CDK复合物黏附使其失活,导致细胞周期停止,从而阻断细胞的增殖过程,即为细胞周期的制动系统。CKI主要分为两类:（1）Cip和Kip类:包括ｐ21Cip1，ｐ27ｋip1及ｐ57ｋip2。(2）INK类:包括ｐ16INK4，ｐ15INK4Ｂ，ｐ18INK4Ｃ及ｐ19INK4Ｄ。这些类型的CKI主要抑制其相应激酶的活性;CKI过量表达可引起细胞周期的阻断。本实验中TGF?β1的真核表达载体转染晶状体上皮细胞株HLEC后,出现了细胞的生长抑制现象,同时还发现以往被认为是Smad4的下游靶基因的 p21在TGF?β1作用后出现了明显增高表达,提示p21参与了该生长抑制过程,可能是通过增高p21的表达来抑制cyclin的作用,令细胞周期停止于G1/S期，同时CDK2的表达亦随时间明显降低。目前已知的TGF?β1的作用机制:上升的TGF?β1能够抑制正常细胞和早期肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡发生。其抑制作用是通过细胞膜上的TGF?βRⅠ和TGF?βRⅡ将信号传导至细胞质,在受体下游信号分子Smad家族等的参与下,最终抑制细胞生长周期G1/S期过渡实现的。在G1早期，TGF?β1诱导的抑制信号直接作用于原癌基因c?myc；而在G1晚期，TGF?β1可通过抑制CDKs的活性及这些酶的活性周期蛋白，包括cyclinA，cyclinE，cyclinD等，从而抑制S期的开始。TGF?β信号传导基本过程为: TGF?β配体与细胞膜受体结合,激活细胞内Smads蛋白,协同多种转录因子,最终导致目的基因表达。Smads类蛋白是TGF?β信号转导通路中必不可少的中介蛋白,存在于胞质中, Smad4是通用枢纽分子,与上游分子形成核转运复合物后,将信号由胞质传入核内,协同转录因子上调或下调靶基因的表达,因而部分肿瘤由于该通路的缺陷而使肿瘤细胞逃逸了TGF?β的生长抑制作用。Smad4由于其中枢作用而被认为是调控TGF?β信号通路的关键分子,它是TGF?β族各类信号转导过程中共同需要的介质,因此Smad蛋白家族作为TGF?β受体信号传递的关键效应分子,在胞膜信号与基因转录间开通了一条最为简捷的路径。本研究的结果显示随着TGF?β1表达的增加,Smad4在转录和翻译水平均有升高，其高表达具有一定的时间消减性。从而说明TGF?β1的Smad4依赖途径参与LEC的增殖抑制过程[5]。目前的研究已经证明，TGF?β引起的晶状体上皮细胞外基质沉积是通过激活Smad信号通路发生的，Saika等通过免疫组化研究证明在损伤引起的晶状体混浊，MET沉积和PCO中，TGF?β受体激活Smad蛋白，Smad3，Smad3/Smad4结合物出现在细胞核，表明 Smad/TGF?β信号途径的激活，同时TGF?β抗体可以阻断Smad3/Smad4的核转位。在Smad3基因敲除鼠和Smad7抑制子转染的人晶状体细胞中，随着Smad信号途径的抑制，损伤引起的细胞外基质沉积也被抑制。由此证明了Smad途径在TGF?β引起的晶状体混浊中起到重要作用 [6?9]。
综上所述,TGF?β1在白内障的发生发展过程中的作用是十分复杂的,通过启动凋亡基因p21,改变细胞周期蛋白CDK2，在分子水平抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期于G1/S期。同时 TGF?β/Smad经典信号传导途径中最重要的Smad4明显升高，证明TGF?β/Smad途径参与了该生长抑制过程,但其具体机制尚需进一步研究。
体育论文发表
【参考文献】
1 Kubo E, Miyazawa T. Development?and age?associated expression pattern of peroxire? doxin6 and its regulation in murine ocular lens. Mech
Ageing Dev 2006;127(3):249?256
2 Lovicu FJ, Schulz MW, Hales AM, et al. TGF induces morphologica land molecular changes typical of anteriorsubcapsular cataract. Br J Ophthalmol 2002; 86（12）: 220?226
3 Xiao Y, Zhao B, Gao Z, et al.Overaccumulation of transforming growthm factor?betal and basic fiboblast growth factor in lens epithelial cells of congenital cataract. Can J Ophthalmol 2009;44(2):189?192
4 Verrecchia F, Tacheau C, Wagner EF, et al. A central role for the Jun?N?terminal kinase pathway in mediating the antagonistic activity of pro?inflammatory cytokines against transforming growth factor?beta?driven Smad3/4?specific gene expression. J Biol Chem 2003; 278(3):1585?1593
5 Weiss C, Schneider S, Wagner EF, et al. JNK phosphorylation relieves HDAC3?depen?dent suppression of the activity of c?Jun. EMBO J 2003;22(14): 3686?3695
6 Saika S, Kawashima Y, Miyamoto Y, et al. Immunolocalization of prolyl 4?hydroxylase subunit, alpha?smooth muscleactin, and extracellular matrix components inhuman lens capsules with lens implants. Exp Eye Res 1998;66: 283?294
7 Saika S,Ohnishi Y,Sato M, et al. Smad 3 signaling is required for epithelial? mesenchymal transition of lens epithelium after injury. Am J Pathol 2004;84(10):1245?1258
8 Saika S, Miyamoto T, Ishida I, et al. TGFbeta?Smad signaling in postoperative humanlens epithelial cells. Br J Ophthalmol 2002;86(12):1428?1433
体育论文发表
9 Saika S, Miyamoto T, Tanaka S, et al. Response of lens epithelial cells to injury: Role of lumican in epithelial?mesenchymaltransition.
Invest Ophthalmol Vis Sci 2003;44(5):2094?2102
【关键词】 晶状体上皮细胞；TGF?β1基因；转染；p21;CDK2;Smad4
Abstract?AIM: To investigate the change of p21,CDK2 and Smad4 on the HLEC transfected with pEGFP?TGF?β1 plasmid and the effect of TGF?β１gene transfection on the cell cycle control of human lens epithelial cell. METHODS:Immortalized human lens epithelial cellline(HLEC? B3) was transfered by pEGFP?TGF?β1 gene. The expression of TGF?β1mRNA,p21mRNA,CDK2mRNA and Smad4 mRNA and protein induced by transfered by TGF?β1 gene were measured by RT?PCR and Western? blot at different time periods .RESULTS: RT?PCR detected that TGF?β1mRNA began to raise after 24h, culminated after 48h ,decreased after 72h,decreased much after 96h,but still more than the normal. p21mRNA companied with it. but CDK2 decreased with it. Western?blot detected that the consequence consisted with RT?PCR.The effect of TGF?β1 gene was demonstrated from the lever of transcription and translation.Smad4 protein raised with the lever of TGF?β1 gene at various time point, but disappeared very quickly.CONCLUSION:TGF?β1 can increase p21,but decrease CDK2,to impact the cell cycle of HLEC. TGF?β/Smad4 pathway take part in the course.
KEYWORDS:lens epithelial cells; TGF?β1; genes transfer; p21;CDK2 ；Smad4
0 引言
转化生长因子?β(TGF?β)可抑制上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞,以及某些肿瘤细胞的生长,并使这些细胞停滞在细胞周期的第一个间隔区：G1期，从而阻止细胞进入S期[1]。许多研究表明，高表达活性 TGF?β1的转基因鼠和其体外培养鼠晶状体均出现晶状体混浊的症状[2,3]，我们的前期实验证明TGF?β1可抑制晶状体上皮细胞增殖，改变细胞周期，诱导其发生凋亡。目前已经发现TGF?β信号传导经典途径为: TGF?β配体与细胞膜受体结合,激活细胞内Smads蛋白,协同多种转录因子,最终导致目的基因表达。Smads类蛋白是TGF?β信号转导通路中必不可少的中介蛋白，存在于胞质中[4]。Smad4是通用枢纽分子,与上游分子形成核转运复合物后,将信号由胞质传入核内,协同转录因子上调或下调靶基因的表达。Smad4由于其中枢作用而被认为是调控TGF?β信号通路的关键分子。我们通过基因转染技术对TGF?β1抑制人晶状体上皮细胞，导致白内障发生的具体作用机制进行探讨。
1 材料和方法
体育论文发表
1.1 材料
永生化细胞系HLEC?B3(中国医科大学眼科),HG?DMEM培养液（美国Highclone公司）,胎牛血清（杭州四季青生物公司）, pSNAV?TGF?β1，pEGFP?C2质粒（北京本元正阳基因技术有限公司），Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）, Trizol试剂盒（GIBCO/BRL公司）; RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0（大连宝生物工程公司）;蛋白质免疫印迹化学发光试剂盒（德国Borhringer Mannheim公司）;鼠抗人CDK2及p21（NEB公司）;生物素标记的蛋白质标准样品,抗生物素标记的蛋白质标准二抗（美国NEB公司）。复苏时将冻存细胞系HLEC ? B3从液氮罐中取出,快速放入37℃温水中溶解,溶化后以1200r/min离心约3～5min,离心半径为15cm。弃培养液后，放入含150mL/L 胎牛血清、100mg/Ｌ青霉素及125mg/Ｌ链霉素的HG?DMEM培养基中,置于50mL/L CO2，37℃的细胞培养箱内培养。EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pSNAV?TGF?β1,回收插入片断（1.8kb），EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pEGFP?C2,回收线性载体(4.7kb)，连接上述二种回收的DNA，转化,筛选克隆，构建后的质粒命名为pEGFP? TGF?β1。
1.2 方法
转染前1ｄ将细胞接种至6孔板,细胞度为1×108个/Ｌ,在50mL/L CO2，37℃饱和湿度下培养24h,90%细胞达到融合;转染前使用PBS缓冲液冲洗细胞1次,更换不含抗生素的培养液。无血清 HG?DMEM250μL稀释pEGFP? TGF?β14μg，温和摇匀。使用前轻轻混匀Lipofectamine2000，然后将Lipofectamine 2000 10μL加入无血清的HG?DMEM 250μL，混匀并于室温温育5min。混合稀释的质粒和Lipofectamine 2000混匀，室温下放置20min。将质粒/Lipofectamine 2000复合物加入到6孔板的孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在50mL/L CO2，37℃饱和湿度下培养，6h后更换含150mL/L胎牛血清的HG?DMEM培养基。将转染细胞,每日在倒置显微镜下观察并记录细胞的形态变化。实验分为pEGFP?TGF?β1转染 24，48，72，96h组；pEGFP?C2转染24，48，72，96h组；正常细胞对照组。提取总RNA,按照Trizol试剂盒说明书进行，参照 Genebank的cDNA序列，用Primer Premier 5软件设计引物:TGF?β1:5? CTGTGGCTACTGGTGCTGAC 3?;5?CATAG ATTTCGTTGTGGGTTTC 3?；p21:5?CCCGTGAGCGATGGAA CT3?;5?CGAGGCACAAGGGTACAAGA3?;CDK2：5?CCGCCT GGACACTGAGACT3?;5?GAGGAGGACCCGATGAGA3?;Smad 4：5?CTGCCAACTTTCCCAACAT 3?;5?AGAAGGGTCCACGT ATCCA 3?;PCR反应按下列组成配制PCR反应液：5×Pcr buffer10μL、灭菌蒸馏水28.75μL,TaKaRa Ex Taq?HS 0.25μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL，将PCR反应液加入到反转录反应结束后的PCR反应管中按下列条件进行PCR反应：94℃预变性 2min，94℃变性30s，50℃～65℃退火30s，72℃延伸0.5～4min，变性至延伸进行30个循环，反应结束后，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。实验重复3离心次。另实验分组同RT?PCR，终止培养后,用冰冷的0.02mol/L PBS冲洗细胞3次,置于冰盒上,用细胞刮取器刮下细胞,置于Eppendorf管内,加入裂解液(2mmol/L/EDTA,10mmol/L /EGTA,20mmol/L/Tris?HCL, pH7.5,2mmol/L MmPMSF, 0.25mol/L蔗糖) 300μL超声粉碎,4℃离心,17500r/min离心2h,将其标准化,将蛋白液样品用120g/LSDS?PAGE分离而后电转移至硝酸纤维膜上, 含50g/L牛血清白蛋白的TTBS封闭1h,加上特异性一抗(1∶400)4℃过夜,TBS洗4次,10min/次,加入碱性磷酸酶(1B2000)，室温孵育2h,加入B?Naphthylacidphosphate和o?dignisidinetetrazotized显色,膜经Kodak1D型凝胶自动成像扫描分析,记录吸光度,实验重复3次。
2 结果
体育论文发表
2.1 TGF?β1，p21，CDK2，Smad4mRNA表达
TGF?β1目的片断319bp，p21目的片断351bp，CDK2目的片断271bp，Smad4目的片断440bp。 pEGFP?TGF?β1转染组TGF?β1 24h开始升高，48h达到最高，72h略有减少，96h明显减少，但仍高于正常组，而空载体组与正常细胞组则无明显变化。p21变化趋势和TGF?β1 相符，CDK2组变化趋势则正好相反，Smad4组48h明显升高，72h下降明显，96h基本恢复正常(图1A?D)。
2.2 Western?blot检测TGF?β1，p21，CDK2，Smad4蛋白的表达Western?blot检测结果和RT?PCR基本相符（图2AD）。
3 讨论
细胞周期调控的研究是近年来细胞生物学研究的热点之一,其核心机制为细胞周期蛋白激酶(cyclin dependent kinase，CDK)的活性表达与调控。CDK的激活是依赖于其调节亚基与胞周期蛋白(cyclin)结合形成复合物而发生作用的。而细胞周期蛋白激酶抑制因子(cyclin dependent kinase,CKI)是一组抑制CDK活性的活性因子,这也是CDK活性调节的另一方式[3，4]。在细胞周期调控的过程中,cyclin与CDK结合形成复合物,推动细胞周期的进程,即形成细胞周期的动力系统。不同类型的cyclin/CDK复合物分别调控细胞周期中细胞生长、DNA复制及细胞分裂等重要过程。CKI通过与cyclin/CDK复合物黏附使其失活,导致细胞周期停止,从而阻断细胞的增殖过程,即为细胞周期的制动系统。CKI主要分为两类:（1）Cip和Kip类:包括ｐ21Cip1，ｐ27ｋip1及ｐ57ｋip2。(2）INK类:包括ｐ16INK4，ｐ15INK4Ｂ，ｐ18INK4Ｃ及ｐ19INK4Ｄ。这些类型的CKI主要抑制其相应激酶的活性;CKI过量表达可引起细胞周期的阻断。本实验中TGF?β1的真核表达载体转染晶状体上皮细胞株HLEC后,出现了细胞的生长抑制现象,同时还发现以往被认为是Smad4的下游靶基因的 p21在TGF?β1作用后出现了明显增高表达,提示p21参与了该生长抑制过程,可能是通过增高p21的表达来抑制cyclin的作用,令细胞周期停止于G1/S期，同时CDK2的表达亦随时间明显降低。目前已知的TGF?β1的作用机制:上升的TGF?β1能够抑制正常细胞和早期肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡发生。其抑制作用是通过细胞膜上的TGF?βRⅠ和TGF?βRⅡ将信号传导至细胞质,在受体下游信号分子Smad家族等的参与下,最终抑制细胞生长周期G1/S期过渡实现的。在G1早期，TGF?β1诱导的抑制信号直接作用于原癌基因c?myc；而在G1晚期，TGF?β1可通过抑制CDKs的活性及这些酶的活性周期蛋白，包括cyclinA，cyclinE，cyclinD等，从而抑制S期的开始。TGF?β信号传导基本过程为: TGF?β配体与细胞膜受体结合,激活细胞内Smads蛋白,协同多种转录因子,最终导致目的基因表达。Smads类蛋白是TGF?β信号转导通路中必不可少的中介蛋白,存在于胞质中, Smad4是通用枢纽分子,与上游分子形成核转运复合物后,将信号由胞质传入核内,协同转录因子上调或下调靶基因的表达,因而部分肿瘤由于该通路的缺陷而使肿瘤细胞逃逸了TGF?β的生长抑制作用。Smad4由于其中枢作用而被认为是调控TGF?β信号通路的关键分子,它是TGF?β族各类信号转导过程中共同需要的介质,因此Smad蛋白家族作为TGF?β受体信号传递的关键效应分子,在胞膜信号与基因转录间开通了一条最为简捷的路径。本研究的结果显示随着TGF?β1表达的增加,Smad4在转录和翻译水平均有升高，其高表达具有一定的时间消减性。从而说明TGF?β1的Smad4依赖途径参与LEC的增殖抑制过程[5]。目前的研究已经证明，TGF?β引起的晶状体上皮细胞外基质沉积是通过激活Smad信号通路发生的，Saika等通过免疫组化研究证明在损伤引起的晶状体混浊，MET沉积和PCO中，TGF?β受体激活Smad蛋白，Smad3，Smad3/Smad4结合物出现在细胞核，表明 Smad/TGF?β信号途径的激活，同时TGF?β抗体可以阻断Smad3/Smad4的核转位。在Smad3基因敲除鼠和Smad7抑制子转染的人晶状体细胞中，随着Smad信号途径的抑制，损伤引起的细胞外基质沉积也被抑制。由此证明了Smad途径在TGF?β引起的晶状体混浊中起到重要作用 [6?9]。
综上所述,TGF?β1在白内障的发生发展过程中的作用是十分复杂的,通过启动凋亡基因p21,改变细胞周期蛋白CDK2，在分子水平抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期于G1/S期。同时 TGF?β/Smad经典信号传导途径中最重要的Smad4明显升高，证明TGF?β/Smad途径参与了该生长抑制过程,但其具体机制尚需进一步研究。
体育论文发表
【参考文献】
1 Kubo E, Miyazawa T. Development?and age?associated expression pattern of peroxire? doxin6 and its regulation in murine ocular lens. Mech
Ageing Dev 2006;127(3):249?256
2 Lovicu FJ, Schulz MW, Hales AM, et al. TGF induces morphologica land molecular changes typical of anteriorsubcapsular cataract. Br J Ophthalmol 2002; 86（12）: 220?226
3 Xiao Y, Zhao B, Gao Z, et al.Overaccumulation of transforming growthm factor?betal and basic fiboblast growth factor in lens epithelial cells of congenital cataract. Can J Ophthalmol 2009;44(2):189?192
4 Verrecchia F, Tacheau C, Wagner EF, et al. A central role for the Jun?N?terminal kinase pathway in mediating the antagonistic activity of pro?inflammatory cytokines against transforming growth factor?beta?driven Smad3/4?specific gene expression. J Biol Chem 2003; 278(3):1585?1593
5 Weiss C, Schneider S, Wagner EF, et al. JNK phosphorylation relieves HDAC3?depen?dent suppression of the activity of c?Jun. EMBO J 2003;22(14): 3686?3695
6 Saika S, Kawashima Y, Miyamoto Y, et al. Immunolocalization of prolyl 4?hydroxylase subunit, alpha?smooth muscleactin, and extracellular matrix components inhuman lens capsules with lens implants. Exp Eye Res 1998;66: 283?294
7 Saika S,Ohnishi Y,Sato M, et al. Smad 3 signaling is required for epithelial? mesenchymal transition of lens epithelium after injury. Am J Pathol 2004;84(10):1245?1258
8 Saika S, Miyamoto T, Ishida I, et al. TGFbeta?Smad signaling in postoperative humanlens epithelial cells. Br J Ophthalmol 2002;86(12):1428?1433
体育论文发表
9 Saika S, Miyamoto T, Tanaka S, et al. Response of lens epithelial cells to injury: Role of lumican in epithelial?mesenchymaltransition.
Invest Ophthalmol Vis Sci 2003;44(5):2094?2102
