钒化钠对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株 Cyclin D1 表达的影响
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发布者：贾平平 吕军 邵国 姜树原 周立社 闫少
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时间：2011年1月20日 10:57
【摘要】 目的: 研究钒化钠对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株细胞周期蛋白（Cyclin）D1表达的影响,探讨钒化钠在细胞生长中的作用机制。方法:以体外培养小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株为研究对象,给予0、0.1、1.0、5.0、10.0、100.0、200.0μmol/L钒化钠,培养4小时后,用 Western blot技术检测小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株Cyclin D1表达情况。结果:5.0、10.0μmol/L钒化钠组培养4小时后,Cyclin D1蛋白表达均增高；100.0、200.0μmol/L钒化钠组培养4小时后，Cyclin D1蛋白表达均降低。结论：钒化钠可通过上调和下调Cyclin D1的蛋白表达的双重作用,来影响细胞的生长。
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【关键词】 钒化钠；NIH3T3细胞；Cyclin D1
Abstract Objective : To study the effect of sodium orthovanadate on the expression of cell cycle protein Cyclin D1 in mouse NIH3T3 cell line. Methods: Mouse NIH3T3 cells grown in cell culture were treated with sodium orthovanadate at doses of 0, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 100.0, 200.0 μmol/L respectively for 4 hours and the cell extracts were subjected to Western blotting technique to examine the expression of cyclin D1. Results： After application for 4 hours, as compared with the control, sodium orthovanadate at the dose of 5.0 or 10.0 μmol/L induces the expression of Cyclin D1 significantly whereas at the dose of 100.0 or 200.0 μmol/L, it causes the reduction of cyclin D1 expression. Conclusion: Sodium orthovanadate may affect the growth of NIH3T3 cells through the bi-directional control of cyclin D1 expression including both down-regulation and up-regulation.
Key words Sodium orthovanadate； NIH3T3 cell； Cyclin D1
细胞周期蛋白（Cyclin）D1是1991年发现的细胞周期蛋白,在静止细胞中不表达,经刺激因子刺激后表达增加[1]。Cyclin D1是调控细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的主要成分,它通过对视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的灭活作用,使细胞从G1期顺利进入S期,促使细胞持续增殖 [2]。近年来，已有学者证实低剂量的钒化钠促进细胞生长分裂，高剂量的钒化钠引发Cyclin D1水平的急剧下降[3]。本实验系统地研究不同浓度钒化钠对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株Cyclin D1表达的影响,探讨钒化钠在细胞生长中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株，购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基（Gibico公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），胰蛋白酶（上海华美生物工程公司），台盼兰（上海华美生物工程公司），二甲基亚砜（Amersco），聚丙烯酰胺凝胶，Cyclin D1抗体，辣根酶标记山羊抗兔Ig抗体，ECL试剂盒（北京中山公司），其他试剂为分析纯。
1.1.3 主要仪器 二氧化碳培养箱（Thermoforma，美国），倒置相差显微镜（XDB-1B），超净工作台（SW-CJ-2F，上海博迅），自动双重纯水蒸馏器（SZ-98，上海本波仪器有限公司），手提式压力蒸汽消毒器（YXQ02型，山东），电热恒温鼓风干燥箱（Gzx-dh.500-bs，上海），电子天平（FA1004，上海恒平科学仪器公司），电泳仪（DF-D，北京），电转膜仪，紫外透视成像系统（KH-UVIII，上海康禾）。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养 小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株在37℃、饱和湿度及5%CO2条件下，用培养瓶在含10%胎牛血清、100Ｕ／mL青链霉素的DMEM培养液中传代培养。
1.2.2 Western blot技术 将NIH3T3细胞株悬液接种于6孔培养皿中,培养至贴壁面积达80%～90%时弃去培养液，换无血清培养基培养12小时,按实验分组分别加入不同浓度的钒化钠，分别为0.1μmol/L、1μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L、100.0μmol/L、200.0μmol/L，对照组不加药物。作用4小时后,用RIPA+PMSF细胞裂解液在冰上裂解细胞，低温离心15分钟提取蛋白，BCA法蛋白定量。加上样缓冲液，100℃变性5 分钟。每孔50μg蛋白上样，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白电转到硝酸纤维膜上,用5%脱脂奶粉封闭1小时，加一抗稀释液(1∶1000稀释)4℃过夜，TTBS洗膜，结合辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5 000稀释),TTBS洗膜，用ECL化学发光试剂在X光胶片上曝光、显影、定影。以β-actin为内参照，应用凝胶成像分析系统进行条带扫描分析结果，结果以蛋白条带的面积积分值与β-actin的面积积分值比值表示。实验重复3次。
1.2.3 统计学处理 采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析,统计数据以均数±标准差（x±s）表示,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
不同浓度钒化钠对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株Cyclin D1蛋白表达的影响见图1，表1。Western blot技术检测结果显示，低浓度钒化钠引起NIH3T3细胞Cyclin D1蛋白表达增加，高浓度钒化钠引起NIH3T3细胞Cyclin D1蛋白表达降低见图2。
图1 Western blot技术分析不同浓度钒化钠处理小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株4小时Cyclin D1和β?actin蛋白表达情况（略）
表1 不同浓度钒化钠对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株Cyclin D1蛋白表达的影响（略）
*与对照组比较P<0.05,**与对照组比较P<0.01
图2 不同浓度钒化钠处理组Cyclin D1蛋白质对β?actin蛋白质的相对丰度（n=3）（略）
*与对照组比较P<0.05,**与对照组比较P<0.01
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3 讨论
钒是化学元素周期表中VB族的过渡元素，广泛存在于自然界中,参与人体许多不同的生理过程,如细胞的生长和分化、糖类及脂类的代谢等[4]。更多研究结果表明，钒化钠和过氧钒化钠还可以在多种细胞体系中起到促进或抑制细胞生长分裂的作用[5]。钒化钠可以通过调节细胞周期相关蛋白实现对细胞生长的调控，G1/S期蛋白Cyclin D1以及G2/M期蛋白P21和Cdc 25C等的表达都受钒化钠影响[3,6]。
细胞周期蛋白Cyclin在细胞增殖和凋亡中有重要作用，对细胞周期的研究表明，在细胞中相关生长因子与相应的受体结合后，通过信号传递促进Cyclin基因的表达，Cyclin与相应的细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）结合形成的复合物[7]，可使得视网膜母细胞瘤蛋白由低磷酸化状态变为磷酸化状态，后者释放转录因子E2F[8],游离的 E2F进入核内结合一系列具有特殊序列的基因启动子，调节这些基因表达，进而推动细胞周期运行。钒化钠对细胞周期的影响是基于对信号通路的作用，钒化钠为蛋白酪氨酸蛋白酶（PTP）抑制剂，PTP在细胞中的主要功能是使酪氨酸激酶脱磷酸化，酪氨酸激酶活性的变化可以改变MAPK和PI3K/PKB信号通路的状态，而Cyclin D1直接或间接受到二者的调节[9]。
本实验结果显示，低浓度钒化钠促进Cyclin D1的表达，高浓度抑制其表达。这与以钒化钠处理 C3H10T1/2细胞的研究结果一致[3]，说明不同浓度钒化钠对Cyclin D1作用不同，提示低浓度钒化钠可以促进细胞增殖的作用，而高浓度抑制其增殖。要进一步阐明钒化钠如何影响Cyclin D1表达进而影响细胞增殖和凋亡的，则需要对钒化钠在细胞信号转导中的作用进行细致深入的研究。
【参考文献】
[1] Viallard JF,Lacombe F,Belloc F,et al.Molecular mechanism controlling the cell cycle:fundamental aspects and implications for oncology[J].Cancer Radiother,2001,5(2):109-129.
[2] Zhou P,Jiang E,Weghorst CM,et al.Overexpression of cyclin D1 enhance gene amplification [J].Cancer Res,1996,56:36-39.
[3] Yan S,Wenner CE.Modulation of cyclin D1 and its signaling components by the phorbol ester TPA and the tyrosine phosphatase inhibitor vanadate[J].J Cell Physiol,2001,186(3):338-349.
[4] Stern A ,Yin X,Tsang SS,et al.Vanadium as a modulator of cellular regulatory cascades and oncogene expression[J].Biochem Cell Biol,1993,71:103-112.
[5] Wang H，Scott RE.Unique and selective mitogenic effects of vanadate on SV40-transformed cells[J].Mol Cell Biochem,1995,153(1-2):59-67.
[6] Zhang Z,Leonard SS,Huang C,et al.Role of reactive oxygen species and MAPKs in vanadate-induced G(2)/M phase arrest[J].Free Radic Biol Med,2003，34(10):1333-1342.
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[7] Sherr CJ.Cancer cell cycles[J].Science,1996,274:1672-1677.
[8] Weinberg RA.The retinoblastoma protain and cell cycle control[J].Cell,1995,81(3):323.
[9] Yan S,Krebs S,Leister KJ,et al.Perturbation of EGF-activated MEK1 and PKB signal pathways by TGF-beta1 correlates with perturbation of EGF-induced cyclin D1 and DNA synthesis by TGF-beta1 in C3H 10T1/2 cells[J].Cell Physiol,2000,185(1):107-116.
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【关键词】 钒化钠；NIH3T3细胞；Cyclin D1
Abstract Objective : To study the effect of sodium orthovanadate on the expression of cell cycle protein Cyclin D1 in mouse NIH3T3 cell line. Methods: Mouse NIH3T3 cells grown in cell culture were treated with sodium orthovanadate at doses of 0, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 100.0, 200.0 μmol/L respectively for 4 hours and the cell extracts were subjected to Western blotting technique to examine the expression of cyclin D1. Results： After application for 4 hours, as compared with the control, sodium orthovanadate at the dose of 5.0 or 10.0 μmol/L induces the expression of Cyclin D1 significantly whereas at the dose of 100.0 or 200.0 μmol/L, it causes the reduction of cyclin D1 expression. Conclusion: Sodium orthovanadate may affect the growth of NIH3T3 cells through the bi-directional control of cyclin D1 expression including both down-regulation and up-regulation.
Key words Sodium orthovanadate； NIH3T3 cell； Cyclin D1
细胞周期蛋白（Cyclin）D1是1991年发现的细胞周期蛋白,在静止细胞中不表达,经刺激因子刺激后表达增加[1]。Cyclin D1是调控细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的主要成分,它通过对视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的灭活作用,使细胞从G1期顺利进入S期,促使细胞持续增殖 [2]。近年来，已有学者证实低剂量的钒化钠促进细胞生长分裂，高剂量的钒化钠引发Cyclin D1水平的急剧下降[3]。本实验系统地研究不同浓度钒化钠对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株Cyclin D1表达的影响,探讨钒化钠在细胞生长中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株，购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基（Gibico公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），胰蛋白酶（上海华美生物工程公司），台盼兰（上海华美生物工程公司），二甲基亚砜（Amersco），聚丙烯酰胺凝胶，Cyclin D1抗体，辣根酶标记山羊抗兔Ig抗体，ECL试剂盒（北京中山公司），其他试剂为分析纯。
1.1.3 主要仪器 二氧化碳培养箱（Thermoforma，美国），倒置相差显微镜（XDB-1B），超净工作台（SW-CJ-2F，上海博迅），自动双重纯水蒸馏器（SZ-98，上海本波仪器有限公司），手提式压力蒸汽消毒器（YXQ02型，山东），电热恒温鼓风干燥箱（Gzx-dh.500-bs，上海），电子天平（FA1004，上海恒平科学仪器公司），电泳仪（DF-D，北京），电转膜仪，紫外透视成像系统（KH-UVIII，上海康禾）。
在哪里发表论文
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株在37℃、饱和湿度及5%CO2条件下，用培养瓶在含10%胎牛血清、100Ｕ／mL青链霉素的DMEM培养液中传代培养。
1.2.2 Western blot技术 将NIH3T3细胞株悬液接种于6孔培养皿中,培养至贴壁面积达80%～90%时弃去培养液，换无血清培养基培养12小时,按实验分组分别加入不同浓度的钒化钠，分别为0.1μmol/L、1μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L、100.0μmol/L、200.0μmol/L，对照组不加药物。作用4小时后,用RIPA+PMSF细胞裂解液在冰上裂解细胞，低温离心15分钟提取蛋白，BCA法蛋白定量。加上样缓冲液，100℃变性5 分钟。每孔50μg蛋白上样，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白电转到硝酸纤维膜上,用5%脱脂奶粉封闭1小时，加一抗稀释液(1∶1000稀释)4℃过夜，TTBS洗膜，结合辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5 000稀释),TTBS洗膜，用ECL化学发光试剂在X光胶片上曝光、显影、定影。以β-actin为内参照，应用凝胶成像分析系统进行条带扫描分析结果，结果以蛋白条带的面积积分值与β-actin的面积积分值比值表示。实验重复3次。
1.2.3 统计学处理 采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析,统计数据以均数±标准差（x±s）表示,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
不同浓度钒化钠对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株Cyclin D1蛋白表达的影响见图1，表1。Western blot技术检测结果显示，低浓度钒化钠引起NIH3T3细胞Cyclin D1蛋白表达增加，高浓度钒化钠引起NIH3T3细胞Cyclin D1蛋白表达降低见图2。
图1 Western blot技术分析不同浓度钒化钠处理小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株4小时Cyclin D1和β?actin蛋白表达情况（略）
表1 不同浓度钒化钠对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株Cyclin D1蛋白表达的影响（略）
*与对照组比较P<0.05,**与对照组比较P<0.01
图2 不同浓度钒化钠处理组Cyclin D1蛋白质对β?actin蛋白质的相对丰度（n=3）（略）
*与对照组比较P<0.05,**与对照组比较P<0.01
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3 讨论
钒是化学元素周期表中VB族的过渡元素，广泛存在于自然界中,参与人体许多不同的生理过程,如细胞的生长和分化、糖类及脂类的代谢等[4]。更多研究结果表明，钒化钠和过氧钒化钠还可以在多种细胞体系中起到促进或抑制细胞生长分裂的作用[5]。钒化钠可以通过调节细胞周期相关蛋白实现对细胞生长的调控，G1/S期蛋白Cyclin D1以及G2/M期蛋白P21和Cdc 25C等的表达都受钒化钠影响[3,6]。
细胞周期蛋白Cyclin在细胞增殖和凋亡中有重要作用，对细胞周期的研究表明，在细胞中相关生长因子与相应的受体结合后，通过信号传递促进Cyclin基因的表达，Cyclin与相应的细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）结合形成的复合物[7]，可使得视网膜母细胞瘤蛋白由低磷酸化状态变为磷酸化状态，后者释放转录因子E2F[8],游离的 E2F进入核内结合一系列具有特殊序列的基因启动子，调节这些基因表达，进而推动细胞周期运行。钒化钠对细胞周期的影响是基于对信号通路的作用，钒化钠为蛋白酪氨酸蛋白酶（PTP）抑制剂，PTP在细胞中的主要功能是使酪氨酸激酶脱磷酸化，酪氨酸激酶活性的变化可以改变MAPK和PI3K/PKB信号通路的状态，而Cyclin D1直接或间接受到二者的调节[9]。
本实验结果显示，低浓度钒化钠促进Cyclin D1的表达，高浓度抑制其表达。这与以钒化钠处理 C3H10T1/2细胞的研究结果一致[3]，说明不同浓度钒化钠对Cyclin D1作用不同，提示低浓度钒化钠可以促进细胞增殖的作用，而高浓度抑制其增殖。要进一步阐明钒化钠如何影响Cyclin D1表达进而影响细胞增殖和凋亡的，则需要对钒化钠在细胞信号转导中的作用进行细致深入的研究。
【参考文献】
[1] Viallard JF,Lacombe F,Belloc F,et al.Molecular mechanism controlling the cell cycle:fundamental aspects and implications for oncology[J].Cancer Radiother,2001,5(2):109-129.
[2] Zhou P,Jiang E,Weghorst CM,et al.Overexpression of cyclin D1 enhance gene amplification [J].Cancer Res,1996,56:36-39.
[3] Yan S,Wenner CE.Modulation of cyclin D1 and its signaling components by the phorbol ester TPA and the tyrosine phosphatase inhibitor vanadate[J].J Cell Physiol,2001,186(3):338-349.
[4] Stern A ,Yin X,Tsang SS,et al.Vanadium as a modulator of cellular regulatory cascades and oncogene expression[J].Biochem Cell Biol,1993,71:103-112.
[5] Wang H，Scott RE.Unique and selective mitogenic effects of vanadate on SV40-transformed cells[J].Mol Cell Biochem,1995,153(1-2):59-67.
[6] Zhang Z,Leonard SS,Huang C,et al.Role of reactive oxygen species and MAPKs in vanadate-induced G(2)/M phase arrest[J].Free Radic Biol Med,2003，34(10):1333-1342.
在哪里发表论文
[7] Sherr CJ.Cancer cell cycles[J].Science,1996,274:1672-1677.
[8] Weinberg RA.The retinoblastoma protain and cell cycle control[J].Cell,1995,81(3):323.
[9] Yan S,Krebs S,Leister KJ,et al.Perturbation of EGF-activated MEK1 and PKB signal pathways by TGF-beta1 correlates with perturbation of EGF-induced cyclin D1 and DNA synthesis by TGF-beta1 in C3H 10T1/2 cells[J].Cell Physiol,2000,185(1):107-116.
