N?乙酰氨基半乳糖转移酶2对胃癌细胞SGC7901黏附迁移能力的影响

【摘要】  目的： 探讨N?乙酰氨基半乳糖转移酶2（Polypeptide：N?acetylgalactosaminytransferases 2，ppGalNAc?T2）对胃癌细胞SGC7901黏附迁移的影响。方法： 将ppGalNAc?T2正义载体（pEGFP?C1?T2）、空载体（pEGFP?C1）及干扰载体(pSilenCircle)转染SGC7901细胞，采用反转录PCR方法检测其在mRNA水平表达，分别通过细胞黏附实验和穿膜实验检测其黏附力和迁移力变化。结果： 转染正义ppGalNAc?T2的SGC7901细胞比转染干扰载体的SGC7901细胞对纤连蛋白、基质胶和透明质酸的黏附能力低，但其侵袭迁移能力没有变化。结论： ppGalNAc?T2低表达可能与肿瘤浸润转移具有相关性。 医学论文发表网

【关键词】  N?乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAc?T2） 胃癌细胞SGC7901 黏附 迁移

    ［Abstract］  Objective: To investigate Polypeptide：N?acetylgalactosaminytransferases 2 （ppGalNAc?T2）′s role during adhesion and migration of gastric cancer cell SGC7901. Methods： To transfect  ppGalNAc?T2 plus sense vector（pEGFP?C1?T2），vacuity vector（pEGFP?C1）and interference vector (pSilenCircle)to SGC7901. We detected express level of ppGalNAc?T2 by RT?PCR and detected the capability change of adhesion and migration by cell adhesion and Transwell essay.  Results： Contrast to SGC7901 which interference vector, the one transfected ppGalNAc?T2 plus sense vector had low adhesion capability to matrigel, hyaluronic acid and fibronectin, but the same migration capability. Conclusion： It was possible that ppGalNAc?T2′s low expression and tumor adhesion and migration had their correlation.

    ［Key words］  N?acetylgalactosaminytransferases 2； gastric cancer cell SGC7901； adhesion； migration

    N?乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAc?T2)及其家族作为黏蛋白O?糖基化的起始酶，可能与肿瘤的黏附和迁移密切相关。肿瘤细胞表面有类似黏蛋白的糖蛋白，含有丰富的O?糖基化位点，在肿瘤的转移和浸润生长过程中黏蛋白起着重要的作用。因此，本实验通过转染正义ppGalNAc?T2、空载体和干扰载体SGC7901细胞，分别检测这4种亚细胞株对基质胶（matrigel）、透明质酸（HA）和纤连蛋白（FN）的黏附力。用Transwell法检测转染后亚细胞株迁移力的变化，以探讨在细胞水平ppGalNAc?T2与胃癌细胞SGC7901黏附迁移的关系。医学论文发表网

    1  材料与方法

    1.1  材  料

    1.1.1  细胞系  人胃腺癌细胞株SGC7901购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。真核表达载体pEGFP?C1由本室保存。

    1.1.2  主要试剂  RPMI1640完全培养基（Gibco,美国）；脂质体2000转染试剂盒（Invitrogen公司）；G418选择性抗生素（Roach公司）；Oligo(dT)，TaqDNA多聚酶、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs),RNA抑制酶（RNase), RNA反转录酶(M?MLV)及DNA相对分子质量标准等均购自晶美公司；Transwell 24孔板、基质胶、透明质酸和纤连蛋白购自上海季美公司。

    1.2  方  法

    1.2.1  胃癌SGC7901细胞正义真核表达载体、空载体和RNA干扰真核表达载体亚细胞株的构建  干扰技术是遵循RNA干扰目标序列的选取原则，利用互联网资源，对ppGalNAc?T2基因mRNA序列设计5条可能性小的干扰RNA（siRNA），并且由PCR方法扩增得到带有RNA pol Ⅲ启动子的siRNA内源表达系统，脂质体介导转染至人胃癌细胞株SGC7901，运用RT?PCR方法检测转染后各细胞株ppGalNAc?T2 mRNA水平的表达变化，筛选出其中ppGalNAc?T2抑制效率最高的siRNA片段；将这段siRNA插入到RNA干扰真核表达载体pSilenCircle中，脂质体介导转染人胃癌细胞株SGC7901,本文在此基础上展开实验。

    将构建好的pEGFP?C1?T2正义真核表达载体、空载体pEGFP?C1和RNA干扰真核表达载体pSilenCircle通过脂质体2000转染胃癌SGC7901细胞，G418筛选2个月内的阳性克隆，获得稳定表达和干扰N?乙酰氨基半乳糖基转移酶基因的单克隆细胞株。由于干扰真核表达载体上无荧光标记故用蛋白质印迹检测ppGalNAc?T2的表达情况，来鉴定干扰载体是否转染成功。

    1.2.2  ppGalNAc?T2 mRNA 表达的 RT?PCR检测  引物序列如下：上游5′?AAGAAAGACCTTCATCACAGCAATGGAGAA?3′，下游5′?ATCAAAACCGCCCTTCAAGTCAGCA?3′，由上海生工生物工程公司合成。收集生长处于对数期的细胞按Trizol Reagent(Invitrogen公司)操作手册提取总RNA，1%甲醛变性琼脂糖电泳检测RNA完整性。取总RNA 2 μg反转录为 cDNA第1链，再进行PCR扩增。扩增产物以2％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，图像分析仪摄像并分析结果。PCR反应体系(50 μl)，反应条件：95℃预变性3 min，95℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 1 min，39个循环，72℃延长10 min。

    1.2.3  琼脂糖凝胶滴试验  培养皿中细胞长到80%时胰酶消化后用完全培养基重悬。按每100 μl琼脂糖滴中含1×106个细胞和0.3%琼脂糖制备悬液。按每滴 1.5 μl的量种植凝胶滴到6孔板中，用0.5 ml完全培养基覆盖，24 h后将琼脂糖胶滴轻轻取出,倒置显微镜下观察凝胶滴以及边缘细胞，并拍照。

    1.2.4  黏附实验  取24孔培养板,每孔分别加入基质胶、透明质酸、纤连蛋白溶液0.2 ml (含20 μg)，置于37℃ CO2培养箱孵育1 h，PBS洗2次，再加入3 %牛血清白蛋白0.2 ml，孵育2 h，PBS洗2遍，包被备用。用无血清PRMI1640液稀释细胞，37℃孵育30 min，其间充分振荡以防细胞凝集。将上述细胞悬液分别接种于已包被的板内, 5×104个细胞(0.5 ml/孔)，于37℃中保温，30，60和90 min时弃去未黏附细胞，用PBS 液轻洗2遍。0.25%胰酶消化后收集黏附细胞计数，黏附百分率=黏附细胞数/总细胞数×100%。

    1.2.5  穿膜实验  包被基底膜：用50 mg/L基质胶1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。每孔加入50 μl含10 g/L BSA的无血清培养液，在下室面铺纤连蛋白，将200 μl枪头的尖端剪掉,吸取纤连蛋白均匀涂抹在小室的下面。用无血清培养基培养细胞12～24 h，使细胞处于饥饿状态。收集细胞，用PBS洗1～2遍，台盼蓝染色检测细胞活力达95%以上，用含BSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度至1×105。取细胞悬液200 μl加入Transwell小室， 24孔板下室加入500 μl含FBS的培养基，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。培养细胞：常规培养8～12 h。用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，苏木精染色、伊红染色等。细胞计数：把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。取有固定的位置15个视野计数细胞个数。

    1.2.6  统计学分析  采用SPSS13.0统计软件包进行统计。数据用±s表示，两组计量资料均数比较呈正态分布且方差齐时用t检验，如非正态分布和（或）方差不齐时用秩和检验，P<0.05表示差异有统计学意义。医学论文发表网

    2  结  果

    2.1  胃癌SGC7901细胞正义和空载体真核表达载体亚细胞株的构建

    带有GFP的正义载体pEGFP?C1?T2和空载体pEGFP?C1成功转入胃癌SGC7901细胞中，可以看到明显绿色荧光（图1）；而没有转染GFP的对照组和干扰组在荧光显微镜下则看不到绿色荧光。

    2.2  蛋白质印迹鉴定干扰载体的转染情况

    RNA干扰真核表达载体转染细胞后无荧光发出,通过蛋白质印迹检测ppGalNAc?T2的表达情况。从图2可以看出，SGC7901?干扰组ppGalNac?T2的表达比其他组低，同时也证明干扰载体被转染。

2.3  RT?PCR检测ppGalNAc?T2 mRNA的表达

    干扰组ppGalNAc?T2的表达明显被干扰，相反，转染正义载体组ppGalNAc?T2的表达有增高，而SGC7901和SGC7901?空ppGalNAc?T2没有变化，见图3。

    2.4  琼脂糖凝胶滴试验

    从图4可以看出，转染正义载体组ppGalNAc?T2的亚细胞株突破胶滴的细胞数明显少于干扰组,干扰组的细胞突破胶滴后贴壁并开始增殖。

    2.5  各亚细胞黏附百分率

    4组亚细胞在不同时间点对细胞外基质的黏附能力不同，差异有统计学意义（P<0.05），见表1～3。表1  基质胶黏附百分率 表2  透明质酸黏附百分率 表3  纤连蛋白黏附百分率综合3个表的结果，SGC7901?T2细胞对细胞外基质成分的黏附能力下降，而SGC7901?干扰细胞对细胞外基质成分的黏附能力上升。

    2.6  穿膜实验HE染色记数

    穿膜实验中分别在24孔Transwell板接种7901，7901?T2，7901?空和7901?SCR细胞后，8 h通过HE染色记数，穿膜百分率分别为（31.43±1.54）%，（28.12±2.57）%，（26.91±2.35）%和（30.78±1.08）%。统计学分析表明4中亚细胞对细胞穿膜能力的差异没有统计学意义。医学论文发表网

    3  讨  论

    单糖、寡糖或多糖与蛋白质连接形成糖蛋白（glycoprotein）。糖蛋白的糖链按照其连接方式的不同，分为两大类：一类是通过氮原子与蛋白质连接的聚糖叫N?连接型糖链(N?linked)，又称N?聚糖，主要存在于血浆蛋白和细胞膜及胞质的糖蛋白中。另一类是通过氧原子与蛋白质连接的聚糖叫O?连接型糖链(O?linked)，又称O?聚糖，主要存在于分泌液中的糖蛋白中，俗称黏蛋白（mucin）［1］。大多数黏蛋白的主要用途是为暴露在环境中的表面保存水分。但是，这些表面未能像皮肤的表面一样被不透水层密封住。因此，黏蛋白必定会出现在消化道、生殖泌尿道和呼吸系统表面。在丝氨酸和苏氨酸残基上添加唾液酸化的聚糖簇群，导致形成强负电荷区，使黏蛋白结合大量水分子。由于其高度水和结构，从黏蛋白释放水分消耗能量，因而降低了蒸发速度［2］。随着许多新的O?糖基转移酶被发现，人们对它们的功能也开始有了新的认识。O?糖基化产生的糖链结构复杂性远高于以往发现的N?聚糖，从而决定了其功能的多样性。已经有人提出，O?糖基化可能与肿瘤的发生发展密切相关［3］。

    ppGalNAc?T2是O?糖基化的起始酶，故推测其在肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。随着ppGalNAc?T2的上调表达，SGC7901细胞增长速度降低，与TGF?β1呈负相关。ppGalNAc?T2这种作用与以前本实验室的研究结果相一致。杨静等［4］在研究全反式维A酸对HL60细胞株三种糖基转移酶家族表达的影响时发现，加入全反式维A酸后HL60细胞株中ppGalNAcT2表达量急剧增加，细胞阻滞在G2／M期，细胞的生长增殖受到抑制，细胞向粒系分化。加入分化诱导剂后细胞发生显著变化，提示ppGalNAcT2与白血病细胞株的分化可能有一定关系。冯冰等［5］在研究全反式维A酸诱导分化的HL60细胞表面凝集素受体的变化时发现，N?乙酰氨基半乳糖结构主要表达于HL60细胞早幼粒阶段，随着细胞的分化成熟而显著减少，其可能是肿瘤特异性抗原。琼脂糖凝胶滴试验中，随着ppGalNAc?T2的上调表达,可以清楚地看到ppGalNAc?T2被干扰后胃癌细胞冲出琼脂糖凝胶滴，在距离胶滴较远的地方贴壁开始复制，表明它的侵袭能力相对其他亚细胞强。SGC7901?干扰在不同时间点对纤连蛋白、基质胶和透明质酸的黏附能力相对其他亚细胞强，推测ppGalNAc?T2参与了细胞表面的识别,很有可能是它使得细胞内外信号传导发生改变或者是影响了特定位点的糖基化。这些证据提示我们ppGalNAc?T2是一个促进细胞分化，抑制细胞增殖的一种酶。因此我们推测ppGalNAc?T2与肿瘤的浸润转移增殖有着密切关系。这为阐明ppGalNAcT2与肿瘤黏附迁移的关系提供了新的思路。医学论文发表网

【参考文献】
  ［1］ Hu Y，Walker S. Remarkable structural similarities between diverse glycosyltransferases［J］. Chem Biol, 2002，9（12）：1287-1296.

［2］ Zhang Y，Iwasaki H，Wang H，et a1.Cloning and characterization of a new human UDP?N?acetyl?alpha?D?galactosamine：Polypeptide N?acetylgalactosaminyltransfease, designated pp?GalNAC?T13,that is specifically expressed in neurons and synthesizes GalNAc alpha?serine/threonine antigen［J］.J Biol Chem,2003,278(1)：573-584.

［3］ Hassan H，Reis CA，Bennett EP，et al.The lectin domain of UDP?N?acetyl?D?galactosamine:Polypeptide N?acetylgalactosaminyltransferase?T4 directs its glycopeptide specificities［J］. J Biol Chem，2000，(49)：38197-38205.

［4］ 杨 静，赵 凝，郭向红,等.全反式维甲酸对HL60细胞株三种糖基转移酶家族表达的影响［J］.中国血液流变学杂志,2006,16(1):26-30.

［5］ 冯 冰，张积仁，肖明星,等.全反式维甲酸诱导分化的HL?60细胞表面凝集素受体的变化［J］.海军医学杂志,2005,26(3):193-195.