复元胶囊抑制骨关节炎大鼠软骨及血清白细胞介素-6的实验研究

【摘要】  目的观察复元胶囊对大鼠骨关节炎(OA)软骨及血清白细胞介素(IL-6)的影响，探讨其抗OA的作用机制。方法Hulth法建立OA模型，随机分为模型组，复元胶囊高、中、低剂量组，同时设对照组。于治疗第4，8，12周取软骨及血清标本，大体观察、Mankin’s评分、免疫组化测定软骨中IL-6表达、酶联免疫吸附法测定血清中IL-6水平，并将软骨及血清IL-6含量与Mankin’s评分指数进行相关分析。结果复元胶囊各组关节软骨Mankin’s评分、软骨及血清中IL-6水平均低于模型组(P﹤0.01);复元胶囊各组Mankin’s评分差异具有显著性(P﹤0.05);模型组及复元胶囊各组软骨及血清中IL-6水平第8周高于4周(P﹤0.01)、12周高于8周(P﹤0.05);软骨及血清中IL-6水平与Mankin’s评分指数呈正相关，相关系数分别为r=0.98(P﹤0.01)，r=0.96(P﹤0.01)。结论复元胶囊对大鼠OA软骨及血清中IL-6具有剂量依赖的抑制作用;软骨及血清中IL-6水平与关节病理改变的Mankin’s评分指数呈正相关。

【关键词】  骨关节炎; 复元胶囊; 白细胞介素-6; 大鼠

骨关节炎(osteoarthritis，OA) 是中老年人常见的慢性、进展性关节疾病，是导致老年人群关节残疾的主要原因。OA以关节软骨退化和破坏为主要病理特征，其发病与衰老、外伤、炎症、代谢、免疫、遗传、过度运动等多种因素有关，但确切发病机制尚不清楚。研究发现，白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)参与介导骨关节炎的免疫及炎症反应，是OA发展中重要的炎症介质。在骨关节炎患者软骨组织及血清中，IL-6含量明显升高，并与病情严重程度相关[1,2]。复元胶囊(Fuyuan capsule,Fyc)为一临床治疗OA的有效复方，前期研究表明，其可减轻软骨病变，抑制IL-1表达[3]。本文主要研究复元胶囊对骨关节炎大鼠软骨及血清IL-6的影响，探讨其抗OA的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品试剂复元胶囊(由重庆希尔安药业公司生产)主要成分为鹿角胶、淫羊霍、黄芪、人参、三七粉、川芎等中药组成，每粒0.41g，每克粉末含生药3g。大鼠IL-6免疫组化试剂盒及ELISA试剂盒由武汉博士德生物科技有限公司提供。

　　1.2 实验方法 雄性SD清洁级大鼠60只，9～10周龄，体质量(300±10)g，由重庆医科大学实验动物中心提供。随机选12只为对照组，行皮肤切开后缝合;其余48只为造模组，采用Hulth法[4]造模。将大鼠用5%水合氯醛按0.7 ml/100 g(体质量)腹腔注射麻醉，无菌条件下剪断内侧副韧带及前后交叉韧带，完整切除内侧半月板，逐层缝合，无菌包扎。术后予青霉素8×104 U·kg-1·d-1,肌肉注射7 d。术后1周将造模动物随机分为模型组，复元胶囊高、中、低剂量组，每组12只，每天驱赶大鼠跑步30min。分别于给药4，8，12周各组随机处死4只大鼠，取血清及软骨标本。

　　1.3 给药方法根据Meeh—Rubner公式计算复元胶囊给药剂量。复元胶囊高、中、低剂量组给药量分别为：371.65，743.30，2 229.90mg·kg-1·d-1;分别配成2 ml溶液于造模后1周开始灌胃。模型组及对照组给予生理盐水2 ml。

　　1.4 观察指标

　　1.4.1 大体观察关节软骨取软骨标本，观察关节囊、滑膜、关节软骨大体形态及有无关节积液，并按以下原则评分：关节面光整，色泽正常为0分;关节面粗糙，有裂隙，色泽灰暗为1分;关节面糜烂，软骨缺损达软骨表中层为2分;关节面溃疡形成，软骨缺损达软骨深层为3分;软骨剥脱，软骨下骨暴露为4分。

　　1.4.2 光镜观察关节软骨取股骨内髁全层软骨及胫骨平台软骨标本置于4%多聚甲醛溶液中固定，10%EDTA脱钙2周，常规石蜡包埋，切片HE染色观察软骨组织的结构、细胞数量和潮线的完整性。依据Mankin’s评分标准进行评分。

　　1.4.3 免疫组化检测软骨IL-6表达待检软骨标本常规石蜡包埋，连续切片5 μm，捞片于多聚赖氨酸防脱处理过的载玻片上，切片脱蜡至水，3%H2O2室温10 min灭活内源性过氧化物酶。冲洗后PBS浸泡5 min，复合消化液修复抗原活性。正常血清封闭，滴加1∶100稀释抗大鼠IL-6抗体(武汉博士德)，4℃孵育过夜。PBS冲洗5 min，3次。滴加生物素标记的二抗(美国SantaCruz公司)，37℃孵育20 min，PBS冲洗5 min，3次。滴加SABC—HRP(美国santa Cruz公司)，37℃孵育20 min。PBS冲洗5 min，3次。二甲基联苯胺(DAB)室温下显色至满意，自来水终止显色反应。苏木素复染细胞20 s，洗去多余染液，酒精梯度脱水后封片，显微镜下观察。图像分析：每个标本取5张切片，每张切片OLYMPUS BX50显微镜下放大400倍，随机取5个视野，用北航医学图像分析管理系统，测定其阳性细胞的百分数。

　　1.4.4 ELISA法测定大鼠血清中 IL-6水平吸取100 μl样品、稀释标准品和质控分别至每孔，加50 μl稀释生物素标记检测抗体后，室温孵育1 h，洗板3次，吸走液体后，加100 μl亲和素-HRP，再室温孵育30min，洗板3次，吸走液体后，每孔加TMB，避光反应12～15 min后，加100μl H2SO4中止反应，于5 min内酶标仪上在450 nm处读取吸光度 (A)值。以标准浓度为横坐标，A值为纵坐标绘制标准曲线，根据标本A值，在标准曲线上查出IL-6的水平，计算结果，以pg/ml表示。

　　1.5 统计学处理所有数据以±s表示，采用SPSS11.0统计软件分析，组间差异显著性检验用F检验，两两比较用q检验，IL-6水平与Mankin’s评分指数采用Pearson相关分析， P<0.05为差异具有统计学意义。

　2 结果

　　2.1 大体观察结果对照组实验过程中，未见明显异常。4周：各造模组关节软骨色稍黄，关节液稍增多，模型组较明显，无明显裂纹、糜烂及溃疡。8周时各造模组病变加重，滑膜增生，软骨面粗糙，呈毛刺状，模型组有裂纹、糜烂和溃疡出现。Fyc各组损伤较模型组轻。12周时Fyc各组部分软骨有裂纹、糜烂及细小溃疡形成。模型组滑膜显著增生，软骨面多见溃疡，可深达骨质，软骨下骨暴露。各组软骨评分见表1。表1 各组关节软骨大体评分与模型组比较，*P<0.05。4周时各组差异无统计学意义;8周，12周时Fyc高、中剂量组与模型组差异有显著性(P<0.05)

　　2.2 光镜观察及Mankin’s评分对照组软骨结构正常，细胞排列整齐。各造模组损伤随时间推移加重，Mankin’s评分差异具有显著性：模型组8周高于4周(P<0.01)、12周高于8周(P<0.01);Fyc各组8周高于4周(P<0.01)，12周高于8周(P<0.05)。各时间点Fyc各组Mankin’s评分低于模型组，以8周及12周差异显著;8周及12周时，Fyc高、中、低剂量组Mankin’s评分差异具有显著性(p<0.05)。各组Mankin’s评分见表2。表2 各组关节软骨Mankin’s评分　与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01;与复元中剂量组比较，#P<0.05

　　2.3 软骨及血清IL-6水平

　　2.3.1 软骨IL-6表达 4，8，12周时IL-6表达造模组较对照组显著升高(P<0.01)，Fyc各剂量组较模型组低，差异具有显著性(高、中剂量组P<0.01，低剂量组P<0.05);各造模组IL-6表达8周较4周时显著升高(P<0.01)，12周较8周时显著升高(模型组P<0.01，Fyc各组P<0.05) ，IL-6表达随时间推移增加;各时段Fyc高、中、低剂量组IL-6表达差异具有显著性(P<0.05);各组IL-6表达见表3。表3 各组关节软骨IL-6表达阳性率与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01;与复元中剂量组比较，# P<0.05，## P<0.01

　　2.3.2 血清IL-6水平 4周，8周，12周时血清IL-6水平造模组较对照组显著升高(P<0.01)，Fyc各剂量组较模型组低，差异具有显著性(P<0.01);各模组血清IL-6水平8周较4周时显著升高(P<0.01)，12周较8周时显著升高(P<0.01) ，血清IL-6随OA发展升高;各时段Fyc高、中、低剂量组血清IL-6水平差异具有显著性(P<0.05)。各组血清IL-6水平见表4。　表4 血清IL-6水平与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01;与复元中剂量组比较，#P<0.05，##P<0.01

　　2.4 Pearson相关分析①软骨IL-6与Mankin’s评分：两者相关系数r=0.98 (P<0.01);②血清IL-6与Mankin’s评分：两者相关系数r=0.96 (P<0.01);③软骨与血清IL-6：两者相关系数r=0.98 (P<0.01)，均呈显著正相关。

　　3 讨论

　　OA是在力学和生物学因素共同作用下，软骨细胞、细胞外基质及软骨下骨三者间分解和合成代谢失衡的结果。炎症及细胞因子通过促进软骨细胞的凋亡及抑制增殖、降低机体抗氧化作用、促进蛋白水解酶产生降解软骨基质以及启动炎症级联反应参与OA的发生发展。

　　IL-6是一种重要的炎症介质，参与介导软骨细胞凋亡及基质降解。血液中IL-6主要来源于活化的单核细胞，局部组织的IL-6主要由滑膜成纤维细胞或局部巨噬细胞产生[5]。正常及OA软骨中分离的软骨细胞都能自发分泌IL-6，免疫组化证实其在关节软骨细胞原位出现。IL-6可诱导破骨细胞形成，增加破骨细胞活性及破骨细胞内MMP-3的表达，在破骨细胞骨基质降解过程中发挥生物学效应[6]。临床研究发现IL-6的抑制剂可减轻滑膜炎症，改善临床症状[7]。IL-6mRNA表达在骨关节炎患者软骨下骨中显著升高，且随软骨病变加重，表达升高[8]。IL-6在骨关节炎犬交叉韧带、髌下脂体、滑膜组织及软骨中表达显著增加[9]; Franchimont N等[10]研究显示，IL-6诱导MMP-13表达，促进软骨基质中二型胶原的降解。此外，IL-6参与诱导ADAMTS-5，而后者是降解软骨基质中蛋白聚糖的主要酶之一，可裂解蛋白聚糖大分子导致软骨基质破坏[11];IL-6还与IL-1β共同参与OA发展过程中的氧化损伤，二者通过失调软骨的抗氧化酶防御作用导致H2O2在软骨细胞线粒体中堆积，引起线粒体损伤，促进软骨细胞的凋亡[12]。这些结果提示在软骨细胞增生和关节软骨的新陈代谢中，IL-6是一种负向调节剂，增强炎症过程，加重关节病变。

　　骨关节炎属于中医“骨痹”“骨萎”“腰腿痛”范畴。《素问·痹论》曰“所谓痹者，各以其时重感于风寒湿三气也”，“故骨痹不已复感于邪，内舍于肾”。本病因年老体衰、跌扑闪挫、过度劳损、肝肾亏虚、元阳不足，温煦鼓动无力，致气血瘀阻，筋脉凝滞，筋骨失养，加之寒湿乘虚侵袭，留注关节导致经脉淤滞而发病。正虚为本，是发病基础，寒湿邪侵是其诱因[13]。该病一方面因虚致病：肾元亏虚，无以主骨生髓，筋骨失养，风寒湿邪入侵而为痹;另一方面因病致虚：风寒湿留着于关节，筋骨劳损，气虚血瘀，久则肾元亏虚，气血不调，脉络失和而为痹。肾元亏虚既是骨痹发生的内在因素，又是骨痹发展的最终归宿。杨清叟提出“肾实则骨有生气”肾虚则骨病;王清任在《医林改错》中提出“痹有瘀血”,加之骨痹为一慢性进展性疾病，“久病多瘀”“久病多虚”，故骨痹的治疗，应重在温补肾元、活血化瘀。复元胶囊配伍淫羊藿、鹿角胶、黄芪、川芎、丹参、三七粉等中药，以补肾益气、活血化瘀立法，为临床治疗骨关节炎的有效复方。本研究中，Fyc各剂量组软骨Mankin’s评分、软骨及血清IL-6水平较模型组低，提示Fyc对大鼠OA有防治作用，其作用可能通过降低关节软骨局部及血清IL-6水平，减轻免疫及炎症反应而实现。Fyc高、中、低剂量组间，软骨病变差异具有显著性，Fyc高剂量组软骨病变最轻，提示Fyc对大鼠OA作用呈剂量依赖性。各组软骨及血清IL-6水平与Mankin’s评分指数、血清IL-6水平与软骨IL-6表达呈显著正相关，提示软骨及血清IL-6水平与OA病情发展及严重程度相关，IL-6可作为OA病情监测指标及药物治疗的作用靶点。软骨及血清IL-6水平在中晚期显著上升，可能提示在OA的中晚期，IL-6水平上升明显，此时其生物活性最强，若采取以IL-6为靶点的治疗措施，如IL-6拮抗剂或受体阻断剂可能收得良好的效果，有力延缓病变进展。

　　综上所述，IL-6与OA的发展密切相关，可作为药物治疗的作用靶点，血清IL-6可作为OA的病情监测指标。复元胶囊的抗OA作用，可能通过降低软骨及血清IL-6水平，减轻炎症及免疫反应，减少软骨基质降解而实现。但其降低IL-6的具体机制，尚需进一步的研究。

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