苦参碱对脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表达的影响
【摘要】 目的 观察不同浓度苦参碱对人脐静脉内皮细胞一氧化氮生成及一氧化氮合酶活性的影响。方法 采用体外培养第3代人脐静脉内皮细胞。实验分为6组，即对照组、不同浓度苦参碱组(50、100、200、500和1000μg/L)。各组细胞于培养 24h 后收集标本，用Griess法检测培养上清中一氧化氮水平，并测定人脐静脉内皮细胞的一氧化氮合酶活性及用内参半定量法分析iNOS mRNA的变化。结果 不同浓度苦参碱组一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性、RNA的表达水平较对照组明显升高(P＜0.05)。结论 苦参碱可增加人脐静脉内皮细胞的一氧化氮合酶活性和一氧化氮产生及RNA的表达水平。
期刊论文发表
【关键词】 苦参碱；一氧化氮合酶活性；内皮细胞；一氧化氮
Abstract：Objective To investigate effects of constant matrine on nitric oxide(NO)production and nitric oxide synthase(NOS)activity in human umbilical vein endothelial cells(HUVEC). Methods The third passage of cultured HUVEC were used.The cells were divided into six groups：control group，diferent matrine group((50μg/L，100μg/L，200μg/L，500μg/L，1000μg/L)Samples were collected 24h after culturing.NO levels in the supernatant were determined using Griess reagent，and NOS activity of hUVEC was dedected.and iNOS mRNA was determined by reverse?transcription PCR(RT?PCR).Semiquantitative analysis of the RT?PCR products was made with a transilluminator. Results NO levels、NOS activity、the level of mRNA expression in matrine group were significantly higher than that in controls(P＜0.05).Conclusion Matrine can excite NO production and NOS activity in HUVEC and intensity?dependently antagonize the effects on NO production.The iNOS mRNA expression will increased when the matrine dosage reaches a certain level.
Key words：endothelial cells；nitric oxide；nitric oxide synthase
苦参(Sophova Flavescens Ait)是豆科槐属植物苦参的干燥根，“性寒味苦”入心、脾、肾三经，始载于《神农本草经》，列为中品，谓其“主心腹积气，瘕积聚”，能“安五脏，定志益精”。《本草经百种录》称“此以味治也，苦入心，寒除火，故苦参专治心经之火”。苦参中的活性成分苦参碱(Matrine)具有较为广泛的生物学作用。据报道苦参碱具有镇咳、平喘、抗炎、降血脂等作用［1-4］。本研究观察了苦参碱对内皮细胞一氧化氮的影响，以探讨苦参碱改善血管内皮功能的可能性，为预防动脉粥样硬化(AS)提供依据。
1 材料和方法 期刊论文发表
1.1 材料
细胞M199培养基、10mmol/L N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素，DAB显色试剂盒为北京中山生物工程公司产品，Trizo为Invitrogen公司产品，PCR试剂盒为 Takara公司产品。CMIAS多功能真彩图像分析仪为北京航空航天大学产品。
1.2 方法
1.2.1 HUVEC的培养和鉴定
取新鲜婴儿脐带，D-Hanks液冲洗，注入0.1mg/L胶原酶，置37℃ D-Hanks液中消化15min，收集酶液，1000r/min 离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬，以2×105/mL的密度接种于培养瓶，于37℃、饱和湿度、50mL/L CO2条件培养，24h后换液。待细胞长满瓶后，1g/L胰酶消化、传代3～5代细胞用于实验。
1.2.2 实验分组及处理
取生长状况良好的第3代细胞，以1×107个细胞数接种于96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，每组5个复孔，并同时进行细胞爬片。细胞在接近融合生长时，换用无血清培养基培养24h。实验随机分为6组：对照组不予苦参碱干预；苦参碱组在培养基中加入苦参碱，剂量分别为50、100、200、500、 1000μg/L。各组细胞接种数目及培养条件一致，均于24h后收集培养液和细胞标本。
1.2.3 一氧化氮浓度测定
用Griess法测定培养基中一氧化氮的稳定代谢产物亚硝酸盐(NO2-)浓度。测定方法按照NO试剂盒说明书操作。收集的培养液与Griess试剂［1%对氨基苯磺酰胺，0.1%N(1萘基)乙二胺，2.5 %磷酸］反应，721分光光度计检测，从亚硝酸钠标准曲线上换算NO值，以fmol/d 表示。
1.2.4 一氧化氮合酶(NOS)活性测定期刊论文发表
按照NOS试剂盒说明书操作。NOS活性测定原理：NOS催化L-精氨酸和分子氧反应形成NO，NO与亲合性物质生成有色化合物，在530nm波长下测定吸光度，以此代表细胞NOS活性。细胞破碎采用超声波法裂解，蛋白定量采用Lowry法。酶活性定义为每毫克组织蛋白酶中生成1nmol NO为一个活性单位。NOS活性=(测定管吸光度-空白管吸光度)÷呈色物纳摩尔消光系数×(反应液总体积÷取液量)×1/(比色光径×时间)÷样品蛋白质含量，其中呈色物纳摩尔消光系数为38.3×10-6。
1.2.5 RNA的提取及筛选
以Trizol试剂提取细胞总RNA。经0.9%琼脂糖凝胶电泳(50mV，1h)确定提取RNA的质量。用核酸定量仪测定样品在260nm处的吸光度(1A=40μg/mL)，确定RNA的浓度。所用RNA的A260/A280应控制在1.80以上。
1.2.6 RT-PCR
取1μL RNA(1g/L)作cDNA模板，以oligodT为引物，按试剂盒操作顺序依次加样，总反应体积为20μL，反应混合物于42 ℃孵育45 min，目的基因iNOS引物序列及内参物β-actin引物序列参照文献［5］设计。iNOS引物序列为：上游5′-CCAGCTAGCCAAAGTCACCAT-3′；下游5′-GTCTCGGAGCCATACAGGATT-3′ ；扩增产物为353bp.β-actin(5′)，5′-caccacaccttctacaatgagc-3′；β-actin(3′)，3′ -gtgatctccttctgcatcctgt-3′扩增产物为695bp。将逆转录产物进行iNOS和β-actin同管扩增。条件为94℃变性后进行下列循环：94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 40s，循环30次。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳(110 mV，30min)分析测定A值。R=(NOS-背景)/(β-actin背景)，R为iNOS mRNA相对于β-actin的相对含量。
1.3 统计学方法
数据以(±s)表示，进行ANOVA 统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果期刊论文发表
2．1 苦参碱对一氧化氮浓度和NOS活性的影响(表1)表1 对人内皮细胞中NO和NOS活性的影响(略)
HUVEC与苦参碱共同培养24h，细胞上清NO 浓度和对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；苦参碱各剂量组细胞NOS活性显著高于对照组，细胞上清NO浓度和细胞NOS活性随着苦参碱浓度的增加而呈浓度依赖性增加(P＜0.05)。
2.2 RNA的提取
由RNA电泳图谱清晰可见28S和18S的条带，比例约为2∶1，测得A260/A280比值在1.7以上，说明RNA提取时没有降解，可用于基因扩增实验。
2.3 RT-PCR及扩增产物电泳分析
电泳结果见图1。内参物β-actin条带扩增均匀，条带位于695bp处；于大约353 bp处可见iNOS 扩增的单一条带。用凝胶分析软件分析各个条带A值，与对照组相比，各苦参碱组扩增产物电泳条带增亮，相对值明显增高(P＜0.05)；其中50μg/L组产物电泳条带比1000μg/L组暗，产量较低，其A 值也明显低于100、200、500μg/L组(P＜0.05)，表2。表2 iNOS mRNA RT-PCR产物电泳条带相对值比较(略)
3 讨论
动脉粥样硬化的发生是血管壁受损伤后引起的一种反应性变化［6］，内皮损伤是重要的始动环节。NO是由血管内皮细胞分泌的舒血管活性物质，对基础状态下血管张力的维持具有重要作用，同时对心血管系统和血液系统具有广泛的生物学效应。苦参碱具有抗炎作用，有明显的抗气道变应性炎症及抑制IL-4mRNA 表达的作用［7］。同时可抑制NF-KB 活化，降低TNF-α、IL-6和ICAM-l的生成；苦参碱也有抗氧化作用，ESR波谱研究表明苦参素有较好的清除羟基自由基的作用，且呈明显量效关系［8］。苦参碱具有降血脂抗氧自由基作用，因高脂血症会损害血管内皮，造成内皮功能障碍［9］，增加内皮细胞超氧阴离子的产生，常伴有血浆NO 水平降低［10］。内皮源性NO 生成减少导致内皮依赖性血管舒张功能受损是高胆固醇血症引起的血管病变和AS 的早期特征［11］。但内皮功能障碍在适当的治疗下是可逆的，NO是一种理想的抗AS因子，提高NO浓度可改善血管内皮功能［12］。本研究表明，苦参碱细胞上清NO水平显著高于正常组。随着喂养细胞苦参碱剂量的增加，NO水平则显著升高，iNOS活力明显增高。苦参碱有一定的促进iNOS基因表达的作用，可能从基因转录和翻译水平对iNOS进行调节，通过促进 NO释放以防止脂质沉积、平滑肌细胞增殖、单核细胞浸润及血小板聚集而起抗动脉粥样硬化内皮细胞损伤的作用。苦参碱对AS 形成的作用机制通过上调NO合成关键酶iNOS的表达并且下调黏附分子的表达来发挥抗氧化、抗炎作用。苦参碱可能促进血管壁中iNOS的活性，升高血液中 NO的含量，这对改善内皮功能与减少心肌缺血具有很实际的意义。
【参考文献】
［1］夏炳南.苦参碱的平喘研究［J］.药学通报，1979，14(2)：85-86.
［2］鲍淑娟.苦参碱的抗炎作用［J］.贵阳医学院学报，1986，11(2)：125-127.
［3］查力.苦参碱对冠状动脉血流量的影响［J］.贵阳医学院学报，1986，11(3)：221-223.
期刊论文发表
［4］许青媛.苦参碱对实验型高血脂症大鼠血液流变学各项指标的改善［J］.陕西新医药，1995，14(7)：230-233.
［5］Simona Cardaropoli，Francesca Silvagno，Emanuella Morra.Infectious and inflammatory stimuli decrease endothelial nitric oxide synthase activity in vitro［J］.Journal of Hypertension，2003，21：2103-2110.
［6］顾耘.动脉粥样硬化病理学研究进展［J］.陕西医学杂志，2005，34(4)：468-470.
期刊论文发表
【关键词】 苦参碱；一氧化氮合酶活性；内皮细胞；一氧化氮
Abstract：Objective To investigate effects of constant matrine on nitric oxide(NO)production and nitric oxide synthase(NOS)activity in human umbilical vein endothelial cells(HUVEC). Methods The third passage of cultured HUVEC were used.The cells were divided into six groups：control group，diferent matrine group((50μg/L，100μg/L，200μg/L，500μg/L，1000μg/L)Samples were collected 24h after culturing.NO levels in the supernatant were determined using Griess reagent，and NOS activity of hUVEC was dedected.and iNOS mRNA was determined by reverse?transcription PCR(RT?PCR).Semiquantitative analysis of the RT?PCR products was made with a transilluminator. Results NO levels、NOS activity、the level of mRNA expression in matrine group were significantly higher than that in controls(P＜0.05).Conclusion Matrine can excite NO production and NOS activity in HUVEC and intensity?dependently antagonize the effects on NO production.The iNOS mRNA expression will increased when the matrine dosage reaches a certain level.
Key words：endothelial cells；nitric oxide；nitric oxide synthase
苦参(Sophova Flavescens Ait)是豆科槐属植物苦参的干燥根，“性寒味苦”入心、脾、肾三经，始载于《神农本草经》，列为中品，谓其“主心腹积气，瘕积聚”，能“安五脏，定志益精”。《本草经百种录》称“此以味治也，苦入心，寒除火，故苦参专治心经之火”。苦参中的活性成分苦参碱(Matrine)具有较为广泛的生物学作用。据报道苦参碱具有镇咳、平喘、抗炎、降血脂等作用［1-4］。本研究观察了苦参碱对内皮细胞一氧化氮的影响，以探讨苦参碱改善血管内皮功能的可能性，为预防动脉粥样硬化(AS)提供依据。
1 材料和方法 期刊论文发表
1.1 材料
细胞M199培养基、10mmol/L N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素，DAB显色试剂盒为北京中山生物工程公司产品，Trizo为Invitrogen公司产品，PCR试剂盒为 Takara公司产品。CMIAS多功能真彩图像分析仪为北京航空航天大学产品。
1.2 方法
1.2.1 HUVEC的培养和鉴定
取新鲜婴儿脐带，D-Hanks液冲洗，注入0.1mg/L胶原酶，置37℃ D-Hanks液中消化15min，收集酶液，1000r/min 离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬，以2×105/mL的密度接种于培养瓶，于37℃、饱和湿度、50mL/L CO2条件培养，24h后换液。待细胞长满瓶后，1g/L胰酶消化、传代3～5代细胞用于实验。
1.2.2 实验分组及处理
取生长状况良好的第3代细胞，以1×107个细胞数接种于96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，每组5个复孔，并同时进行细胞爬片。细胞在接近融合生长时，换用无血清培养基培养24h。实验随机分为6组：对照组不予苦参碱干预；苦参碱组在培养基中加入苦参碱，剂量分别为50、100、200、500、 1000μg/L。各组细胞接种数目及培养条件一致，均于24h后收集培养液和细胞标本。
1.2.3 一氧化氮浓度测定
用Griess法测定培养基中一氧化氮的稳定代谢产物亚硝酸盐(NO2-)浓度。测定方法按照NO试剂盒说明书操作。收集的培养液与Griess试剂［1%对氨基苯磺酰胺，0.1%N(1萘基)乙二胺，2.5 %磷酸］反应，721分光光度计检测，从亚硝酸钠标准曲线上换算NO值，以fmol/d 表示。
1.2.4 一氧化氮合酶(NOS)活性测定期刊论文发表
按照NOS试剂盒说明书操作。NOS活性测定原理：NOS催化L-精氨酸和分子氧反应形成NO，NO与亲合性物质生成有色化合物，在530nm波长下测定吸光度，以此代表细胞NOS活性。细胞破碎采用超声波法裂解，蛋白定量采用Lowry法。酶活性定义为每毫克组织蛋白酶中生成1nmol NO为一个活性单位。NOS活性=(测定管吸光度-空白管吸光度)÷呈色物纳摩尔消光系数×(反应液总体积÷取液量)×1/(比色光径×时间)÷样品蛋白质含量，其中呈色物纳摩尔消光系数为38.3×10-6。
1.2.5 RNA的提取及筛选
以Trizol试剂提取细胞总RNA。经0.9%琼脂糖凝胶电泳(50mV，1h)确定提取RNA的质量。用核酸定量仪测定样品在260nm处的吸光度(1A=40μg/mL)，确定RNA的浓度。所用RNA的A260/A280应控制在1.80以上。
1.2.6 RT-PCR
取1μL RNA(1g/L)作cDNA模板，以oligodT为引物，按试剂盒操作顺序依次加样，总反应体积为20μL，反应混合物于42 ℃孵育45 min，目的基因iNOS引物序列及内参物β-actin引物序列参照文献［5］设计。iNOS引物序列为：上游5′-CCAGCTAGCCAAAGTCACCAT-3′；下游5′-GTCTCGGAGCCATACAGGATT-3′ ；扩增产物为353bp.β-actin(5′)，5′-caccacaccttctacaatgagc-3′；β-actin(3′)，3′ -gtgatctccttctgcatcctgt-3′扩增产物为695bp。将逆转录产物进行iNOS和β-actin同管扩增。条件为94℃变性后进行下列循环：94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 40s，循环30次。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳(110 mV，30min)分析测定A值。R=(NOS-背景)/(β-actin背景)，R为iNOS mRNA相对于β-actin的相对含量。
1.3 统计学方法
数据以(±s)表示，进行ANOVA 统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果期刊论文发表
2．1 苦参碱对一氧化氮浓度和NOS活性的影响(表1)表1 对人内皮细胞中NO和NOS活性的影响(略)
HUVEC与苦参碱共同培养24h，细胞上清NO 浓度和对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；苦参碱各剂量组细胞NOS活性显著高于对照组，细胞上清NO浓度和细胞NOS活性随着苦参碱浓度的增加而呈浓度依赖性增加(P＜0.05)。
2.2 RNA的提取
由RNA电泳图谱清晰可见28S和18S的条带，比例约为2∶1，测得A260/A280比值在1.7以上，说明RNA提取时没有降解，可用于基因扩增实验。
2.3 RT-PCR及扩增产物电泳分析
电泳结果见图1。内参物β-actin条带扩增均匀，条带位于695bp处；于大约353 bp处可见iNOS 扩增的单一条带。用凝胶分析软件分析各个条带A值，与对照组相比，各苦参碱组扩增产物电泳条带增亮，相对值明显增高(P＜0.05)；其中50μg/L组产物电泳条带比1000μg/L组暗，产量较低，其A 值也明显低于100、200、500μg/L组(P＜0.05)，表2。表2 iNOS mRNA RT-PCR产物电泳条带相对值比较(略)
3 讨论
动脉粥样硬化的发生是血管壁受损伤后引起的一种反应性变化［6］，内皮损伤是重要的始动环节。NO是由血管内皮细胞分泌的舒血管活性物质，对基础状态下血管张力的维持具有重要作用，同时对心血管系统和血液系统具有广泛的生物学效应。苦参碱具有抗炎作用，有明显的抗气道变应性炎症及抑制IL-4mRNA 表达的作用［7］。同时可抑制NF-KB 活化，降低TNF-α、IL-6和ICAM-l的生成；苦参碱也有抗氧化作用，ESR波谱研究表明苦参素有较好的清除羟基自由基的作用，且呈明显量效关系［8］。苦参碱具有降血脂抗氧自由基作用，因高脂血症会损害血管内皮，造成内皮功能障碍［9］，增加内皮细胞超氧阴离子的产生，常伴有血浆NO 水平降低［10］。内皮源性NO 生成减少导致内皮依赖性血管舒张功能受损是高胆固醇血症引起的血管病变和AS 的早期特征［11］。但内皮功能障碍在适当的治疗下是可逆的，NO是一种理想的抗AS因子，提高NO浓度可改善血管内皮功能［12］。本研究表明，苦参碱细胞上清NO水平显著高于正常组。随着喂养细胞苦参碱剂量的增加，NO水平则显著升高，iNOS活力明显增高。苦参碱有一定的促进iNOS基因表达的作用，可能从基因转录和翻译水平对iNOS进行调节，通过促进 NO释放以防止脂质沉积、平滑肌细胞增殖、单核细胞浸润及血小板聚集而起抗动脉粥样硬化内皮细胞损伤的作用。苦参碱对AS 形成的作用机制通过上调NO合成关键酶iNOS的表达并且下调黏附分子的表达来发挥抗氧化、抗炎作用。苦参碱可能促进血管壁中iNOS的活性，升高血液中 NO的含量，这对改善内皮功能与减少心肌缺血具有很实际的意义。
【参考文献】
［1］夏炳南.苦参碱的平喘研究［J］.药学通报，1979，14(2)：85-86.
［2］鲍淑娟.苦参碱的抗炎作用［J］.贵阳医学院学报，1986，11(2)：125-127.
［3］查力.苦参碱对冠状动脉血流量的影响［J］.贵阳医学院学报，1986，11(3)：221-223.
期刊论文发表
［4］许青媛.苦参碱对实验型高血脂症大鼠血液流变学各项指标的改善［J］.陕西新医药，1995，14(7)：230-233.
［5］Simona Cardaropoli，Francesca Silvagno，Emanuella Morra.Infectious and inflammatory stimuli decrease endothelial nitric oxide synthase activity in vitro［J］.Journal of Hypertension，2003，21：2103-2110.
［6］顾耘.动脉粥样硬化病理学研究进展［J］.陕西医学杂志，2005，34(4)：468-470.
