同型半胱氨酸对乳腺癌患者外周血单核细胞组织因子表达的影响
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时间：2011年3月21日 13:48
【摘要】 目的 探讨Hcy是否诱导乳腺癌患者外周血单核细胞(Monocyte，Mn)表达组织因子(TF)。方法 用不同浓度Hcy ［12.5μmol/L(Ⅱ组)、25μmol/L(III组)、100μmol/L(Ⅳ组)、50μmol/L(V组)］对乳腺癌患者外周血Mn进行短期培养后，粉碎细胞，ELISA方法检测其TF表达。结果 随着Hcy浓度的增加，TF在乳腺癌患者外周血单核细胞的表达水平逐步增高，并呈剂量依赖性。其中Ⅰ组与III、Ⅳ、V组比较差异有统计学意义(P均＜0.01)；Ⅱ组与Ⅳ、V组间比较，III组与Ⅳ组、III组与V组间比较差异均有统计学意义；Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅱ组与III组、Ⅳ组与V组间比较差异无统计学意义。结论 Hcy通过诱导乳腺癌患者外周血Mn表达TF，从而在乳腺癌的侵袭和转移中发挥一定的作用。
教育教学论文发表
【关键词】 同型半胱氨酸；单核细胞；组织因子；乳腺癌
Abstract：Objective To explore the effects of homocysteine on expression of tissue factor(TF)in peripheral monocyte in cases with breast carcinoma.Methods T The peripheral monocyte were incubated with the culturing liquid of different Hcy concentrations for short time，and then smashed.The levels of TF was detected using ELISA method.Results As incubated with Hcy，monocytic cells can be induced to express TF，which is upregulated in dose-dependent pattern.Among the groups，there is statistical difference between group Ⅰand group III,groupⅠ and group Ⅳ,group Ⅰand group V,group Ⅱand group Ⅳ,group Ⅱand group V,group III and group V.Conclusion Hcy induce Monocytic cells to express TF and play a rore in the invasion and metastasis of the breast carcinoma.
Key words：homocysteine；monocyte cell；tissue factor；breast carcinoma
乳腺癌的侵袭和转移是一个多步骤、多因素参与的、非常复杂的过程。既往多认为，巨噬细胞是抗肿瘤免疫调节过程中的一种重要细胞群，可以直接杀伤肿瘤细胞，或者通过呈递肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答从而清除肿瘤。但是近年来逐渐认识到，肿瘤间质中的巨噬细胞并非发挥抗肿瘤作用，而是参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移的过程［1-2］。近年研究显示［3-5］，组织因子(tissue factor，TF)的高表达参与肿瘤新生血管的形成，促进恶性肿瘤的侵袭和转移。相关资料也显示，同型半胱氨酸(homocysten，Hcy)在乳腺癌等多种恶性肿瘤患者血浆中的水平显著升高［6-7］，但是，关于Hcy与乳腺癌侵袭和转移直接关系的研究，以及Hcy、单核细胞 (Monocyte，Mn)、TF之间关系的研究方面的资料很少。所以，本研究通过对不同浓度的Hcy培养下，人乳腺癌患者外周血Mn、TF表达情况的研究，确定Hcy是否通过刺激Mn表达TF，初步探讨Hcy、Mn、TF之间的关系。从而进一步了解乳腺癌侵袭和转移的病理机制，探寻乳腺癌预防、治疗的新途径。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取2006年5月—2006年11月收住我院、经组织病理学确诊的女性乳腺癌初治患者20例，年龄30～73岁，平均46.7岁，排除高血压、肾病、糖尿病及心、脑血管等疾病。
教育教学论文发表
1.2 主要试剂
Hcy纯品(瑞士Fluka 公司生产，由迪马公司提供)，脂多糖(由宁夏医学院药理学教研室提供)，淋巴细胞分离液(上海第二试剂厂生产)，细胞上清TF、ELISA试剂盒(美国 BPB公司生产，由泛邦公司提供)，RPMI(GIBCO BRL公司生产)，胎牛血清(中国医学科学院血液研究所生产)。
1.3 方法
1.3.1 标本采集和单个核细胞分离及培养
单个核细胞(MNC)包括淋巴细胞和Mn，但淋巴细胞并不表达TF，因此本研究主要采用MNC来研究Mn的TF表达。晨间采空腹静脉血5mL，放入含 0.109mol/L枸橼酸钠抗凝管中，混匀。MNC的分离采用密度梯度法：枸橼酸钠抗凝血经Hank's液稀释加入装有淋巴细胞分离液的试管中，离心、洗涤后，调整MNC浓度为(1～10)×106个/mL，用RPMI 1640培养液培养4h，培养后-70℃保存。瑞氏染色法确定MNC中Mn含量为33.7%，台盼蓝染液染色测细胞存活率＞95%。采用不同浓度［12.5μmol/L(Ⅱ组)、25μmol/L(III组)、100μmol/L(Ⅳ组)、50μmol/L(V组)］Hcy的RPMI 1640完全培养液，培养条件：体积分数5%CO2、37℃，饱和湿度的恒温培养箱中培养，同时设阳性(脂多糖，100mg/mL，Ⅵ组)和阴性 (PBS，I组)对照。
1.3.2 细胞粉碎和检测
取出冷冻的细胞，常温下融化，用超声细胞粉碎机JY92-ⅡDN 900W，均匀粉碎细胞(1min)后待测。ELISA方法测定细胞悬液TF的浓度(严格按照试剂说明操作步骤进行检测)。
1.4 统计学方法
应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理分析。所有计量资料均以均数±标准差(±s)表示。多组均数之间比较采用ANOVA方差分析，组间的两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
2.1 不同浓度Hcy培养下，乳腺癌患者外周血单个核细胞TF的表达水平(见表1)表1 不同浓度Hcy培养下，乳腺癌患者外周血单个核细胞TF的表达情况（略）
随着Hcy浓度的增加，TF在乳腺癌患者外周血单核细胞的表达水平逐步增高。其中Ⅰ组与III、Ⅳ、V组间比较差异有统计学意义(P均＜0.01)；Ⅰ组与Ⅱ组间比较差异无统计学意义(P=0.128)。Ⅱ组与Ⅳ、V组间比较差异有统计学意义(P=0.022和0.002)；Ⅱ组与III组比较差异无统计学意义(P=0.327)。III组与V组比较差异有统计学意义(P=0.030)；III组与Ⅳ组间比较差异无统计学意义(P=0.182)。Ⅳ组与V 组间比较差异无统计学意义(P=0.389)。
3 讨论
Hcy是蛋氨酸(methionine，Met)代谢过程中产生的一种含硫氨基酸，是胱硫醚和Met转硫化和甲基化代谢旁路中形成的中间体。正常人体 Hcy含量很少，一般健康成人空腹血浆Hcy范围约在10umol/L左右，如果任何原因造成了Hcy代谢障碍，就有可能引起Hcy在体内蓄积，导致高 Hcy血症。
近年研究发现，高Hcy血症与恶性肿瘤密切相关。流行病学资料显示［8］，血清Hcy水平升高显著增加女性宫颈癌发生的危险性，血清Hcy水平最高的 3/4患者与血清Hcy水平最低的1/4患者相比，宫颈癌发生的危险性增加2～3倍〔完全调整后(包括血清学HPV-16状态)RR=2.4～3.2；P=0.01〕。临床资料［6-7］也发现，血浆Hcy水平在结直肠癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、食管癌、卵巢癌等众多恶性肿瘤患者中显著升高，血浆Hcy的水平升高在恶性肿瘤中可能具有普遍性。此外，体外细胞实验及临床研究也发现［9］，Hcy水平的升高与肿瘤细胞增殖活性显著相关，与活细胞的数量呈正相关；在肿瘤患者中，血清Hcy水平的升高与血清肿瘤标志物水平的升高一致；并且，血清Hcy的水平更能反应体内肿瘤细胞的活性。
既往多认为，巨噬细胞是抗肿瘤免疫调节过程中的一种重要细胞群，可以直接杀伤肿瘤细胞，或者通过呈递肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答从而清除肿瘤。但是近年来逐渐认识到，肿瘤间质中的巨噬细胞并非发挥抗肿瘤作用，而是参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移的过程，在许多人类肿瘤，肿瘤微环境所含巨噬细胞的数量与预后不良相关。从基因水平消除巨噬细胞的乳腺癌小鼠模型显示，肿瘤发展和转移减弱，侵袭性的肿瘤细胞被限制在基质，而使瘤细胞不能逃逸到循环并且播散到远处。因此，巨噬细胞是被肿瘤来源的趋化因子吸引到侵袭的前沿，通过分泌趋化因子和细胞因子，破坏基底膜而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭［1-2］。
本实验采用MNC，MNC主要是淋巴细胞和单核细胞，单核细胞能分泌TF，而正常淋巴细胞不表达TF，因此，本实验实际上就是测试的单核细胞的TF表达。本试验证实，单核细胞分泌TF，TF为凝血过程的重要启动因子。现已证实TF分子胞外区是与Ⅶ/Ⅶa结合并激活凝血的关键部位，具有促凝活性和蛋白水解的功能，而胞内区功能是近年方为人们初步认识：胞内区末端3个丝氨酸残基磷酸化具有细胞内信号传导功能，能促进血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor，VEGF)的转录和合成［3-4］。在炎症和重塑信号的作用下，单核细胞趋化到肿瘤细胞的周围，由于TF与细胞因子受体超家族成员具有同形性，因此，由炎症和恶性肿瘤细胞产生的细胞因子和生长因子诱导TF的异常表达，TF的异常表达又能促进生长因子的异常表达，从而增加肿瘤组织新生血管形成，促进肿瘤的侵袭和转移，促进疾病进展。
本实验结果显示，Mn在正常培养的条件下有少量TF表达，而病理浓度的Hcy可以诱导Mn表达TF，并呈现剂量依赖性。提示肿瘤组织微环境的改变，单核细胞趋化到肿瘤细胞周围，肿瘤组织局部高Hcy可诱导单核细胞表达TF等细胞因子，进而促进瘤细胞的侵袭和转移。
【参考文献】
［1］王建伟，刘颖斌，曹明智，等.乳腺癌肿瘤相关巨噬细胞与血管生成关系的研究［J］.实用肿瘤杂志，2005，20(1)：46-48.
［2］Alana L Welm，Julie B Sneddon，Carmen Taylor，et al.The macrophage-stimulating protein pathway promotes metastasis in a mouse model for breast cancer and predicts poor prognosis in humans［J］.PNAS，2007，104：7570-7575.
教育教学论文发表
［3］Mattias Belting，Jasimuddin Ahamed，Wolfram Ruf.Signaling of the Tissue Factor Coagulation Pathway in Angiogenesis and Cancer［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25：1545-1550.
［4］Joanne L Yu，Linda May，Vladimir Lhotak，et al.Oncogenic events regulate tissue factor expression in colorectal cancer cells：implications for tumor progression and angiogenesis［J］.Blood，2005，105：1734-1741.
［5］郭艳丽，闫慧明，杨林花，等.组织因子、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体在乳腺癌中的表达［J］.中国肿瘤，2005，14(2)：130-132.
［6］王亚萍，肖锦华，顾筱敏，等.消化系恶性肿瘤患者血浆Hcy水平检测及临床分析［J］.放射免疫学杂志，2005，18(5)：368-369.
［7］乔蕊，张捷，汪整辉，等.7种肿瘤患者血浆同型半胱氨酸水平的初步探讨［J］.现代检验医学杂志，2006，21(5)：7-10.
［8］Regina G Ziegler，Stephanie J Weinstein，Thomas R Fears. Nutritional and Genetic Inefficiencies in One-Carbon Metabolism and Cervical Cancer Risk［J］.J Nutr，2002，132：2345S-2349S.
［9］Chien-Feng Sun，Thomas R Haven，Tsu-Lan Wu，et al.Serum total homocysteine increases with the rapid proliferation rate of tumor cells and decline upon cell death：a potential new tumor marker［J］.Clinica Chimica Acta，2002，321：55-62.教育教学论文发表
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【关键词】 同型半胱氨酸；单核细胞；组织因子；乳腺癌
Abstract：Objective To explore the effects of homocysteine on expression of tissue factor(TF)in peripheral monocyte in cases with breast carcinoma.Methods T The peripheral monocyte were incubated with the culturing liquid of different Hcy concentrations for short time，and then smashed.The levels of TF was detected using ELISA method.Results As incubated with Hcy，monocytic cells can be induced to express TF，which is upregulated in dose-dependent pattern.Among the groups，there is statistical difference between group Ⅰand group III,groupⅠ and group Ⅳ,group Ⅰand group V,group Ⅱand group Ⅳ,group Ⅱand group V,group III and group V.Conclusion Hcy induce Monocytic cells to express TF and play a rore in the invasion and metastasis of the breast carcinoma.
Key words：homocysteine；monocyte cell；tissue factor；breast carcinoma
乳腺癌的侵袭和转移是一个多步骤、多因素参与的、非常复杂的过程。既往多认为，巨噬细胞是抗肿瘤免疫调节过程中的一种重要细胞群，可以直接杀伤肿瘤细胞，或者通过呈递肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答从而清除肿瘤。但是近年来逐渐认识到，肿瘤间质中的巨噬细胞并非发挥抗肿瘤作用，而是参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移的过程［1-2］。近年研究显示［3-5］，组织因子(tissue factor，TF)的高表达参与肿瘤新生血管的形成，促进恶性肿瘤的侵袭和转移。相关资料也显示，同型半胱氨酸(homocysten，Hcy)在乳腺癌等多种恶性肿瘤患者血浆中的水平显著升高［6-7］，但是，关于Hcy与乳腺癌侵袭和转移直接关系的研究，以及Hcy、单核细胞 (Monocyte，Mn)、TF之间关系的研究方面的资料很少。所以，本研究通过对不同浓度的Hcy培养下，人乳腺癌患者外周血Mn、TF表达情况的研究，确定Hcy是否通过刺激Mn表达TF，初步探讨Hcy、Mn、TF之间的关系。从而进一步了解乳腺癌侵袭和转移的病理机制，探寻乳腺癌预防、治疗的新途径。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取2006年5月—2006年11月收住我院、经组织病理学确诊的女性乳腺癌初治患者20例，年龄30～73岁，平均46.7岁，排除高血压、肾病、糖尿病及心、脑血管等疾病。
教育教学论文发表
1.2 主要试剂
Hcy纯品(瑞士Fluka 公司生产，由迪马公司提供)，脂多糖(由宁夏医学院药理学教研室提供)，淋巴细胞分离液(上海第二试剂厂生产)，细胞上清TF、ELISA试剂盒(美国 BPB公司生产，由泛邦公司提供)，RPMI(GIBCO BRL公司生产)，胎牛血清(中国医学科学院血液研究所生产)。
1.3 方法
1.3.1 标本采集和单个核细胞分离及培养
单个核细胞(MNC)包括淋巴细胞和Mn，但淋巴细胞并不表达TF，因此本研究主要采用MNC来研究Mn的TF表达。晨间采空腹静脉血5mL，放入含 0.109mol/L枸橼酸钠抗凝管中，混匀。MNC的分离采用密度梯度法：枸橼酸钠抗凝血经Hank's液稀释加入装有淋巴细胞分离液的试管中，离心、洗涤后，调整MNC浓度为(1～10)×106个/mL，用RPMI 1640培养液培养4h，培养后-70℃保存。瑞氏染色法确定MNC中Mn含量为33.7%，台盼蓝染液染色测细胞存活率＞95%。采用不同浓度［12.5μmol/L(Ⅱ组)、25μmol/L(III组)、100μmol/L(Ⅳ组)、50μmol/L(V组)］Hcy的RPMI 1640完全培养液，培养条件：体积分数5%CO2、37℃，饱和湿度的恒温培养箱中培养，同时设阳性(脂多糖，100mg/mL，Ⅵ组)和阴性 (PBS，I组)对照。
1.3.2 细胞粉碎和检测
取出冷冻的细胞，常温下融化，用超声细胞粉碎机JY92-ⅡDN 900W，均匀粉碎细胞(1min)后待测。ELISA方法测定细胞悬液TF的浓度(严格按照试剂说明操作步骤进行检测)。
1.4 统计学方法
应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理分析。所有计量资料均以均数±标准差(±s)表示。多组均数之间比较采用ANOVA方差分析，组间的两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
教育教学论文发表
2 结果
2.1 不同浓度Hcy培养下，乳腺癌患者外周血单个核细胞TF的表达水平(见表1)表1 不同浓度Hcy培养下，乳腺癌患者外周血单个核细胞TF的表达情况（略）
随着Hcy浓度的增加，TF在乳腺癌患者外周血单核细胞的表达水平逐步增高。其中Ⅰ组与III、Ⅳ、V组间比较差异有统计学意义(P均＜0.01)；Ⅰ组与Ⅱ组间比较差异无统计学意义(P=0.128)。Ⅱ组与Ⅳ、V组间比较差异有统计学意义(P=0.022和0.002)；Ⅱ组与III组比较差异无统计学意义(P=0.327)。III组与V组比较差异有统计学意义(P=0.030)；III组与Ⅳ组间比较差异无统计学意义(P=0.182)。Ⅳ组与V 组间比较差异无统计学意义(P=0.389)。
3 讨论
Hcy是蛋氨酸(methionine，Met)代谢过程中产生的一种含硫氨基酸，是胱硫醚和Met转硫化和甲基化代谢旁路中形成的中间体。正常人体 Hcy含量很少，一般健康成人空腹血浆Hcy范围约在10umol/L左右，如果任何原因造成了Hcy代谢障碍，就有可能引起Hcy在体内蓄积，导致高 Hcy血症。
近年研究发现，高Hcy血症与恶性肿瘤密切相关。流行病学资料显示［8］，血清Hcy水平升高显著增加女性宫颈癌发生的危险性，血清Hcy水平最高的 3/4患者与血清Hcy水平最低的1/4患者相比，宫颈癌发生的危险性增加2～3倍〔完全调整后(包括血清学HPV-16状态)RR=2.4～3.2；P=0.01〕。临床资料［6-7］也发现，血浆Hcy水平在结直肠癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、食管癌、卵巢癌等众多恶性肿瘤患者中显著升高，血浆Hcy的水平升高在恶性肿瘤中可能具有普遍性。此外，体外细胞实验及临床研究也发现［9］，Hcy水平的升高与肿瘤细胞增殖活性显著相关，与活细胞的数量呈正相关；在肿瘤患者中，血清Hcy水平的升高与血清肿瘤标志物水平的升高一致；并且，血清Hcy的水平更能反应体内肿瘤细胞的活性。
既往多认为，巨噬细胞是抗肿瘤免疫调节过程中的一种重要细胞群，可以直接杀伤肿瘤细胞，或者通过呈递肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答从而清除肿瘤。但是近年来逐渐认识到，肿瘤间质中的巨噬细胞并非发挥抗肿瘤作用，而是参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移的过程，在许多人类肿瘤，肿瘤微环境所含巨噬细胞的数量与预后不良相关。从基因水平消除巨噬细胞的乳腺癌小鼠模型显示，肿瘤发展和转移减弱，侵袭性的肿瘤细胞被限制在基质，而使瘤细胞不能逃逸到循环并且播散到远处。因此，巨噬细胞是被肿瘤来源的趋化因子吸引到侵袭的前沿，通过分泌趋化因子和细胞因子，破坏基底膜而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭［1-2］。
本实验采用MNC，MNC主要是淋巴细胞和单核细胞，单核细胞能分泌TF，而正常淋巴细胞不表达TF，因此，本实验实际上就是测试的单核细胞的TF表达。本试验证实，单核细胞分泌TF，TF为凝血过程的重要启动因子。现已证实TF分子胞外区是与Ⅶ/Ⅶa结合并激活凝血的关键部位，具有促凝活性和蛋白水解的功能，而胞内区功能是近年方为人们初步认识：胞内区末端3个丝氨酸残基磷酸化具有细胞内信号传导功能，能促进血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor，VEGF)的转录和合成［3-4］。在炎症和重塑信号的作用下，单核细胞趋化到肿瘤细胞的周围，由于TF与细胞因子受体超家族成员具有同形性，因此，由炎症和恶性肿瘤细胞产生的细胞因子和生长因子诱导TF的异常表达，TF的异常表达又能促进生长因子的异常表达，从而增加肿瘤组织新生血管形成，促进肿瘤的侵袭和转移，促进疾病进展。
本实验结果显示，Mn在正常培养的条件下有少量TF表达，而病理浓度的Hcy可以诱导Mn表达TF，并呈现剂量依赖性。提示肿瘤组织微环境的改变，单核细胞趋化到肿瘤细胞周围，肿瘤组织局部高Hcy可诱导单核细胞表达TF等细胞因子，进而促进瘤细胞的侵袭和转移。
【参考文献】
［1］王建伟，刘颖斌，曹明智，等.乳腺癌肿瘤相关巨噬细胞与血管生成关系的研究［J］.实用肿瘤杂志，2005，20(1)：46-48.
［2］Alana L Welm，Julie B Sneddon，Carmen Taylor，et al.The macrophage-stimulating protein pathway promotes metastasis in a mouse model for breast cancer and predicts poor prognosis in humans［J］.PNAS，2007，104：7570-7575.
教育教学论文发表
［3］Mattias Belting，Jasimuddin Ahamed，Wolfram Ruf.Signaling of the Tissue Factor Coagulation Pathway in Angiogenesis and Cancer［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25：1545-1550.
［4］Joanne L Yu，Linda May，Vladimir Lhotak，et al.Oncogenic events regulate tissue factor expression in colorectal cancer cells：implications for tumor progression and angiogenesis［J］.Blood，2005，105：1734-1741.
［5］郭艳丽，闫慧明，杨林花，等.组织因子、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体在乳腺癌中的表达［J］.中国肿瘤，2005，14(2)：130-132.
［6］王亚萍，肖锦华，顾筱敏，等.消化系恶性肿瘤患者血浆Hcy水平检测及临床分析［J］.放射免疫学杂志，2005，18(5)：368-369.
［7］乔蕊，张捷，汪整辉，等.7种肿瘤患者血浆同型半胱氨酸水平的初步探讨［J］.现代检验医学杂志，2006，21(5)：7-10.
［8］Regina G Ziegler，Stephanie J Weinstein，Thomas R Fears. Nutritional and Genetic Inefficiencies in One-Carbon Metabolism and Cervical Cancer Risk［J］.J Nutr，2002，132：2345S-2349S.
［9］Chien-Feng Sun，Thomas R Haven，Tsu-Lan Wu，et al.Serum total homocysteine increases with the rapid proliferation rate of tumor cells and decline upon cell death：a potential new tumor marker［J］.Clinica Chimica Acta，2002，321：55-62.教育教学论文发表
