利用DM-5大孔树脂富集长春花中的文多灵的研究

摘要】  目的优化DM-5大孔吸附树脂分离纯化长春花中文多灵的洗脱条件。方法采用大孔吸附树脂色谱法，以不同体积分数乙醇水溶液进行洗脱以分离富集文多灵，并进行高效液相色谱(HPLC)跟踪检测。结果 长春花中文多灵主要富集在70%乙醇洗脱液中，自海南文昌引种的长春花中文多灵含量为0.19%，明显高于自海南三亚引种的长春花中文多灵的含量0.03%。结论 DM-5大孔吸附树脂对长春花中文多灵的分离纯化效果良好，此方法操作简单、重复性好，具有较好的工业化前景。

【关键词】  长春花; 文多灵; 大孔吸附树脂

长春花Catharanthus roseus (L.) G. Don是一种广布于热带地区的抗癌药物的资源植物，在海南分布于万宁、文昌、陵水、三亚、东方等地。全草药用，可用于治疗白血病、单核细胞性白血病、横纹肌软骨病、肺癌、胃癌、子宫癌、淋巴肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、火烫伤、高血压病、高血糖等症[1，2]。迄今为止，已经从该植物中分离出一百五十余种生物碱， 可分为单吲哚生物碱，如具有重要用途的文多灵(vindoline);二聚吲哚生物碱长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)等[2]。文多灵又称文朵灵、文多林、文朵灵碱、长春花朵宁和长春刀灵，是合成长春碱和长春新碱的前体[3]。目前长春碱和长春新碱是非常有价值的肿瘤化疗药物[4]。此外，动物实验表明，文多灵具有降血糖、利尿和降血脂作用，还对某些病原菌有抑制作用[5]。

　　随着对文多灵药用功能研究的不断深入，其用途也越来越被广泛揭示，市场需求日益增加，目前长春花已在海南大面积种植。近年来各国学者采用多种方法对长春花中生物碱进行分析和分离，发现国内长春花系列品种中海南产长春花中文多灵的含量最高[6]，而且海南不同地区长春花品种叶中文多灵的含量不同[7]。同时已有较多研究表明大孔吸附树脂对于生物碱具有良好的吸附效能。最近，张琳等[8]利用大孔树脂吸附分离长春花中的文多灵、长春质碱和长春碱，效果明显强于传统的硅胶和氧化铝载体。本研究采用DM-5大孔吸附树脂富集自海南文昌、三亚引种到海口的长春花中的文多灵，并利用HPLC检测文多灵的含量，优化其洗脱条件，为深入开发利用海南产长春花中的文多灵提供科学依据。

　　1 材料与仪器

　　1.1 材料与试剂2007-03在海南海口中国热带农业科学院热带生物技术研究所生物检测中心基地采集长春花植株地上部位，采集的两个品种分别是从海南三亚和文昌引种到海口的长春花，编号分别为cch-a2070315和cch-b2070315，经中国热带农业科学院热带生物技术研究所代正福副研究员鉴定，标本保存在本研究室。DM-5大孔吸附树脂(南开化工厂);文多灵标准品(海南国栋公司);甲醇(色谱纯 美国Burdick & Jackson)、甲醇(分析纯)、乙腈(色谱纯 美国Burdick&Jackson)、三乙胺(色谱纯 美国Burdick & Jackson)、磷酸(分析纯)、去离子水(实验室自制)。

　　1.2 仪器层析柱、精密pH计(梅特勒)、烘干箱(PHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司)、电子天平(Sartorius BP221S)、超声波发生器(德国EHMA T820/H)、真空旋转蒸发仪(瑞士 BUCHI Vacuum controuer V-800)、DIONEX 高效液相色谱仪(UVD170U，P680 HPLC Pump)。

　　2 方法

　　2.1 树脂的预处理称量DM-5树脂2 kg，加乙醇(浓度>95%)浸泡24 h，用2BV乙醇，以1.5 BV/h的流速正向通过树脂层，并保持液面高度，最后保留一定量的乙醇，浸泡12 h，然后用2 BV～4 BV水，以1.5 BV/h的流速正向通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色混浊为止。再用2 BV的1 mol/L HCl溶液，以2 BV/h的流速正向通过树脂层，并浸泡2 h～4 h，而后用纯水以同样流速洗至出水pH中性;加入2 BV～3 BV 1 mol/L NaOH溶液以2.0 BV/h的流速正向通过树脂层，而后用纯水以同样流速洗至出水pH中性。取适量装入玻璃色谱柱 (40 cm×2.4 cm)。

　　2.2 洗脱条件的研究样品上柱后依次用水，30%，53%，70%，90%乙醇水溶液适量进行洗脱，流量为8 ml/min。

　　2.3 树脂的再生用80%乙醇2 000 ml洗柱至变白色，再用4 000 ml水洗至无乙醇味，分离柱即可重复使用。

　　2.4 长春花中总生物碱的提取和文多灵的含量测定同时采集两种长春花，将采集的样品经50℃烘干、粉碎、过60目筛后备用。取等量长春花样品，用80%的甲醇浸泡，超声提取3次，30min/次，合并滤液，减压浓缩，加适量水稀释后过滤。进行DM-5大孔树脂吸附，然后用30%，53%，70%，90%乙醇水梯度洗脱。各流份分别减压蒸干，称重，用色谱纯甲醇溶解定容。离心，取上清、微量移液枪取10 μl 定容至1 ml。文多灵标准品配制成0.45 mg/ml，以上样品均用0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。

　　2.5 色谱条件[9] 色谱柱：Kromasil ODS C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm) 流动相为水：二乙胺=986∶14，用磷酸调pH=7.2(溶液B);甲醇∶乙腈=4∶1(溶液A)，380ml B+620ml A作为流动相，检测波长：262 nm，流速： 1 ml/min;进样量为10 μl。

　　3 结果

　　3.1 DM-5大孔树脂对长春花中的文多灵的富集通过将不同洗脱条件获得的样品与文多灵标准品进行TLC对照分析和HPLC检测，发现自海南三亚和文昌引种到海口的长春花中的文多灵均富集在只有70%乙醇水洗脱液中，文多灵的回收率分别为86.5%，89.2%。见图1～3。目前，生产长春花生物碱的方法主要采用多次含氯溶剂萃取、硅胶或氧化铝柱色谱、多次结晶等过程，工艺复杂。萃取溶剂、柱色谱洗脱液因含氯，结晶溶剂使用甲醇，造成环境污染严重;而长春花类生物碱与硅胶、氧化铝填料间键合力强, 即使长时间洗脱，生物碱也不能完全洗出，而且该填料很难再生利用[8];已有较多研究表明[10，11]，大孔吸附树脂对生物碱具有良好的吸附性能。大孔吸附树脂是一种吸附性与筛选性原理相结合的分离材料，具有吸附容量大、再生简单、效果可靠，能耗低，收率高及兼具浓缩能力等优点。尤其适用于黄酮类、皂苷类、生物碱类等成分的提取分离及大规模生产[12，13]。本试验选用的DM-5型大孔树脂，是一种专用于生物碱的非极性大孔树脂，本研究发现能较好的富集长春花中的文多灵。

3.2 利用HPLC测定文多灵的含量

　　3.2.1 标准曲线的制备配制标准品溶液，文多灵标准品配制成0.45 mg/ ml按2，4，6，8，10 μl进样。以进样量为横坐标，峰积分面积为纵坐标进行回归分析，制得标准曲线： Y=15.096X(R2=0.999 8)。

　　3.2.2 加样回收率测定取已知含量的同一长春花样品3份，分别加入精确称量的0.3 mg标准品，按前面的方法提取和测定，其加样回收率为93.4%。

　　3.2.3 精密度和稳定性检验 取同一标准品溶液，连续进样5次，根据峰面积值计算RSD值(n=5)为0.96%，2 d内间隔进样，计算RSD值(n=5)为2.35%，结果表明样品在2 d内稳定。

　　2.3.4 重复性实验取同一样品按相同的提取分离和测定方法，进行3次重复性实验，测得自海南文昌、三亚引种到海口的长春花及其7%乙醇洗脱物中文多灵的含量。见表1。表1 利用HPLC测定不同样品中文多灵的含量

　　4 讨论

　　据报道，文多灵在长春花中的含量很低，一般在万分之几到千分之几之间，不同产地的长春花中含量也不相同[7]。在长春花育种上，筛选和培育高文多灵含量的品种也是一个重要育种目标。根据张琳等[8]对不同长春花系列品种包括我国海南产长春花品种以及太平洋系列、地中海系列等23个品种中文多灵含量进行测定，结果表明购自海南文昌的长春花种子在种植后的8月份盛花期叶中的文多灵含量高达0.23%，为测试品种中最高。本研究发现自海南文昌引种到海口的长春花在3月份地上部分中文多灵含量明显比自三亚引种到海口的长春花中文多灵含量高。这一结果与文献报道基本一致，但含量较低，原因可能在于采集时间和采集部位的不同。本研究可以初步得出自海南文昌引种的长春花品种具有广泛的应用价值，该富集工艺具有较好的工业化前景。

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