尾加压素Ⅱ体外促进晶状体上皮细胞增殖的细胞信号转导机制
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时间：2011年3月05日 10:37
【摘要】 目的：探讨尾加压素Ⅱ (urotensin Ⅱ, U?Ⅱ) 促进晶状体上皮细胞（lens epithelial cell, LEC）增殖的细胞信号转导机制。方法：采用U?Ⅱ与体外培养的LEC共同孵育，并用4种细胞信号转导阻断剂H7，PD98059，W7，尼卡地平 (nicardipine) 分别作用于LEC，再用3H –胸腺嘧啶（3H?TdR）掺入法检测LEC增殖的情况。结果：U?Ⅱ组LEC的3H掺入放射活性显著高于对照组(P<0.01)，4种信号转导阻断剂组的放射活性与U?Ⅱ组比较均有不同程度的降低(P<0.01，P<0.01)。PD98059 和H7 的阻断作用强于nicardipine 和W7（F= 13.251，P<0.01）。 结论：尾加压素Ⅱ促进LEC增殖是通过细胞信号转导的机制，该作用可被信号转导阻断剂所阻断。学术论文发表
【关键词】 尾加压素Ⅱ；晶状体上皮细胞；增殖；细胞信号转导；后发性白内障
Abstract?AIM：To study the mechanism on signal transduction of proliferation induced by urotensin?Ⅱ(U?Ⅱ)in lens epithelial cell（LEC）. METHODS：U?Ⅱ were incubated with cultured LEC. Meanwhile four blockers of signal transduction, H7, PD98059, W7 and nicardipine, were incubated with LEC separately. Then the proliferations of LEC were detected via 3H?TdR incorporation. RESULTS：The radioactivity of 3H?TdR in U?Ⅱ group was higher than that in control group(P<0.01). The radioactivities of 3H?TdR in groups of four blockers decreased in varying degrees compared with U?Ⅱ group(P<0.01，P<0.01). The blocking effects of PD98059 and H7 were higher than that of nicardipine and W7（F= 13.251，P<0.01）. CONCLUSION：U?Ⅱ induced LEC proliferation by means of signal trasduction which can be blocked by four signal transduction blockers. The result provides a new thinking for prevention and treatment of after cataract.
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KEYWORS：urotensin Ⅱ; lens epithelial cell; proliferation; signal transduction; after cataract
0 引言
尾加压素Ⅱ（urotensin Ⅱ, U?Ⅱ）是一种具有多种生物学效应的新型生物活性物质。最早由Coulouarn于1998年从人体中克隆出人U?Ⅱ（human urotensin Ⅱ, hU?Ⅱ）[1]。此后的研究表明，体内多种组织中含有U?Ⅱ。U?Ⅱ不仅具有强烈的缩血管作用[2] ，而且具有促进细胞增殖的作用，可使大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞和血管平滑肌细胞等发生增殖[3]。我们曾发现眼部各组织均含有U? Ⅱ，并发现U?Ⅱ具有促进晶状体上皮细胞（lens epithelial cell, LEC）增殖的作用。后发性白内障 (after cataract)是白内障囊外摘除联合人工晶状体植入术后的主要并发症。其病理生理机制是手术后残留的LEC发生增殖、移行，使晶状体后囊膜发生混浊导致视力再度下降。我们拟探讨U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导机制，为防治后发性白内障寻求新的途径。
1 材料和方法
学术论文发表
1.1 材料
无菌操作取健康新鲜小牛眼的晶状体前囊膜，用胰蛋白酶消化法，在37℃，5%CO2培养箱中进行晶状体上皮细胞原代和传代培养，取第3代细胞进行如下实验。hU?Ⅱ，H7，PD98059，W7，尼卡地平(nicardipine)均系美国Sigma公司产品，DMEM培养基为美国GIBCO公司产品， 3H –胸腺嘧啶（3H?TdR）购自上海原子核研究所，2,5?二苯基恶唑（PPO）及1,4?双?（5?苯基恶唑基?2）?苯（POPOP）为中国医药集团上海化学试剂公司产品，胰蛋白酶（trypsin）购自华美生物工程公司，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，冰醋酸、二甲苯为市售分析纯产品。本研究采用CO2培养箱（美国FORMA 2111）、倒置研究显微镜（日本Olympus IMT?413）、低温冰箱（日本MDF?V5410）、真空泵（美国Nulgene EF006）、微量移液器（法国Gilson）、γ?液闪计数仪（西安FJ2003PS）。
1.2 方法
将实验分成6组，每组8个样本。对照组在LEC中加入胎牛血清和DMEM培养液。U?Ⅱ组在对照组的基础上加入终浓度为10?8mol/L的 U?Ⅱ。H7组、PD98059组、W7组和尼卡地平组分别在U?Ⅱ组的基础上加入4种细胞信号转导阻断剂，终浓度分别为H7 10?5mol/L，PD98059 10?5mol/L，W7 10?6mol/L，Nicardipine 10?5mol/L。取第3代培养的LEC并使细胞生长同步化。在CO2培养箱中继续培养12h后，按照上述实验分组，分别加入hU?Ⅱ和 H7，PD98059，W7和尼卡地平。将LEC在CO2培养箱中继续培养12h后，吸去培养液，每孔分别加入3H?TdR（其放射比活性为每孔 3.7×104个/min），继续培养12h。吸去培养液，消化细胞并用真空泵抽滤，将细胞收集于玻璃纤维膜上。于60℃,30min条件下烘干滤膜，用液闪计数仪测定 3H放射活性。
统计学分析：用SPSS 12.0统计软件分析。所有结果用均数± 标准差（ ±s）表示。各组与对照组间数据比较采用t检验，各组间数据比较采用单因素方差One?Way ANOVA分析。
2 结果
U?Ⅱ组LEC的3H掺入放射活性（个/min）显著高于对照组 (2027.4±109.1 vs 1203.8±107.6，P<0.01)，说明U?Ⅱ使LEC发生明显的增殖。4种信号转导阻断剂组的放射活性与U?Ⅱ组比较均有不同程度的降低 (1819.6±47.2，1759.1±169.0，1557.9±71.9，1442.9±192.4，P<0.01, P<0.01)，显示这4组LEC的增殖减少，表明4种阻断剂均不同程度地阻断了U?Ⅱ促进LEC增殖的信号转导途径。在4种阻断剂中，PD98059组和H7 组的放射活性显著低于W7组和Nicardipine组（F=13.251，P<0.01），表明PD98059组和H7 组对U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导途径的阻断作用更强（表1）。表13H?TdR掺入法检测4种信号转导阻断剂对U?Ⅱ诱导LEC增殖的影响 (略)
3 讨论
U?Ⅱ是一种生长抑素样环型结构的神经肽，最早提取自鱼的尾部下垂体，1998年首次从人体克隆出来。研究表明，U?Ⅱ是具有多种生物学效应的新型生物活性物质，具有较强的促进多种细胞增殖的作用。U?Ⅱ可刺激离体培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)发生增殖，呈浓度依赖关系；降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、IL?10等均能抑制由U?Ⅱ诱导的VSMC增殖；U?Ⅱ上调VSMC内皮素基因表达并促进VSMC内皮素的合成释放；肾上腺髓质素可浓度依赖性地抑制U?Ⅱ刺激的VSMC内皮素mRNA水平的增加[4?6]。还有报道U?Ⅱ能促进实验大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞发生增殖，且在一定的浓度范围内其促增殖作用具有浓度依赖性。有关U?Ⅱ促进细胞增殖作用的细胞信号转导机制已有报道[7]，U?Ⅱ促进细胞增殖的途径与Ca2+介导的信号转导通路有密切关系。另有文献指出[8]，抑制与有丝分裂有关的多种信号蛋白分子，如c?src，PKC(protein kinase C)，CaM?PK，MAPK(mitogen activated protein kinase)，钙调神经磷酸酶(CaN)，均可在不同程度上抑制U?Ⅱ的有丝分裂效应，从而抑制U?Ⅱ刺激细胞增殖的作用。Watanabe等[9] 研究发现，PKCCaMGPCRMAPK的阻断剂可抑制U?Ⅱ对VSMC的增殖作用，从而间接表明U?Ⅱ是通过PKCCaMGPCRMAPK信号转导途径发挥其促增殖的作用。
学术论文发表
我们曾发现，眼内各组织中均有一定量的U?Ⅱ，U?Ⅱ能显著促进LEC发生明显的增殖并呈浓度依赖关系。在此基础上，我们采用3H?TdR掺入法检测4种细胞信号转导阻断剂对U?Ⅱ促进LEC增殖的影响，以探讨U?Ⅱ促进LEC 增殖的信号转导机制。这4种信号转导阻断剂中，H7是蛋白激酶C（PKC）抑制剂，PD98059是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂，W7是钙调素（CaM）抑制剂，尼卡地平(Nicardipine)是钙通道阻滞剂。研究结果发现，4种信号转导阻断剂均能降低LEC的放射活性、阻断U?Ⅱ促进 LEC增殖的信号转导通路，使U?Ⅱ促进LEC增殖的作用减弱。间接表明U?Ⅱ是通过DG蛋白激酶C途径、受体酪氨酸蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶途径、 Ca2+和钙调蛋白激酶途径等细胞信号转导途径发挥其促进LEC增殖的作用，从而探明了U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导机制。
白内障囊外摘除联合人工晶状体植入手术后残留的LEC发生增殖，并移行至后囊下形成再生的晶状体结构如珍珠样（Elschnig）小体及 Soemmering环，再向成纤维细胞转化、分泌胶原形成纤维膜, 使晶状体后囊膜发生混浊，导致白内障术后视力再度下降。这是后发性白内障的主要病理生理过程。我们的前期研究发现U?Ⅱ能促进LEC增殖，提出其很可能是后发性白内障的一个重要发生机制。我们的研究结果发现，4种细胞信号转导阻断剂均能阻断U?Ⅱ促进LEC增殖的信号转导通路，使U?Ⅱ促进LEC增殖作用减弱。该结果一方面表明U?Ⅱ促进LEC增殖的作用及其细胞信号转导机制，阐明了后发性白内障发生发展的可能机制；另一方面揭示采用信号转导阻断剂可阻断U?Ⅱ促LEC增殖作用，减少白内障手术后的后囊膜混浊，提出这可能是防治后发性白内障的一个新途径。经广泛查阅国内外文献，有关U?Ⅱ促进晶状体上皮细胞等眼内组织细胞增殖的研究尚未见报道，更未见U?Ⅱ促进LEC增殖作用的细胞信号转导机制的研究报道，本研究具有一定的科学意义和应用前景。
【参考文献】
1 Matsushita M, Shichiri M, Fukai N, et al. Urotensin II is an autocrine/paracrine growth factor for the porcine renal epithelial cell line. Endocrinol 2003;144（5）:1825?1831
2 Maguire JJ, Kue RE, Davenport AP. Ophen?receptor ligand human urotensin II: receptor localization in human tissues and comparison of vasoconstrictor responses with endothelin?1. Br J Pharmacol 2000;131(3):441?446
学术论文发表
3 张勇刚, 陈亚红, 马春艳, 等. 尾加压素的促丝裂作用．中国动脉硬化杂志 2001;9(1):14?16
4 夏春芳,霍勇,尹航, 等. IL?10对尾加压素II诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响．北京大学学报(医学版) 2001;33(4):332?334
5 齐永芬, 夏春芳, 陈亚红, 等. 肾上腺髓质素对尾加压素II刺激的血管平滑肌细胞增殖的影响．中国病理生理杂志 2002;18(3):230?232
6 袁杰,李菊香,李国华,等.降钙素基因相关肽对尾加压素II诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响．贵阳医学院学报 2002；21(3):129?132
7 强正浩, 张孙曦, 李菊香, 等. 钙信号在尾加压素?II促血管平滑肌增殖中的作用．北京大学学报（医学版）2002; 34(3):261?265
8 陈亚红, 赵鸣武, 夏春芳, 等. 尾加压素在大鼠气管平滑肌细胞增殖中的作用及其机制．中华医学杂志 2002;80(12):928?930
9 Watanabe T, Pakala R, Katagiri T, et al. Synergistic effect of urotensin?II with mildly oxidized LDL on DNA synthesis on vascular smooth muscle cells. Circulation 2001;4(1):16?18
【关键词】 尾加压素Ⅱ；晶状体上皮细胞；增殖；细胞信号转导；后发性白内障
Abstract?AIM：To study the mechanism on signal transduction of proliferation induced by urotensin?Ⅱ(U?Ⅱ)in lens epithelial cell（LEC）. METHODS：U?Ⅱ were incubated with cultured LEC. Meanwhile four blockers of signal transduction, H7, PD98059, W7 and nicardipine, were incubated with LEC separately. Then the proliferations of LEC were detected via 3H?TdR incorporation. RESULTS：The radioactivity of 3H?TdR in U?Ⅱ group was higher than that in control group(P<0.01). The radioactivities of 3H?TdR in groups of four blockers decreased in varying degrees compared with U?Ⅱ group(P<0.01，P<0.01). The blocking effects of PD98059 and H7 were higher than that of nicardipine and W7（F= 13.251，P<0.01）. CONCLUSION：U?Ⅱ induced LEC proliferation by means of signal trasduction which can be blocked by four signal transduction blockers. The result provides a new thinking for prevention and treatment of after cataract.
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KEYWORS：urotensin Ⅱ; lens epithelial cell; proliferation; signal transduction; after cataract
0 引言
尾加压素Ⅱ（urotensin Ⅱ, U?Ⅱ）是一种具有多种生物学效应的新型生物活性物质。最早由Coulouarn于1998年从人体中克隆出人U?Ⅱ（human urotensin Ⅱ, hU?Ⅱ）[1]。此后的研究表明，体内多种组织中含有U?Ⅱ。U?Ⅱ不仅具有强烈的缩血管作用[2] ，而且具有促进细胞增殖的作用，可使大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞和血管平滑肌细胞等发生增殖[3]。我们曾发现眼部各组织均含有U? Ⅱ，并发现U?Ⅱ具有促进晶状体上皮细胞（lens epithelial cell, LEC）增殖的作用。后发性白内障 (after cataract)是白内障囊外摘除联合人工晶状体植入术后的主要并发症。其病理生理机制是手术后残留的LEC发生增殖、移行，使晶状体后囊膜发生混浊导致视力再度下降。我们拟探讨U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导机制，为防治后发性白内障寻求新的途径。
1 材料和方法
学术论文发表
1.1 材料
无菌操作取健康新鲜小牛眼的晶状体前囊膜，用胰蛋白酶消化法，在37℃，5%CO2培养箱中进行晶状体上皮细胞原代和传代培养，取第3代细胞进行如下实验。hU?Ⅱ，H7，PD98059，W7，尼卡地平(nicardipine)均系美国Sigma公司产品，DMEM培养基为美国GIBCO公司产品， 3H –胸腺嘧啶（3H?TdR）购自上海原子核研究所，2,5?二苯基恶唑（PPO）及1,4?双?（5?苯基恶唑基?2）?苯（POPOP）为中国医药集团上海化学试剂公司产品，胰蛋白酶（trypsin）购自华美生物工程公司，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，冰醋酸、二甲苯为市售分析纯产品。本研究采用CO2培养箱（美国FORMA 2111）、倒置研究显微镜（日本Olympus IMT?413）、低温冰箱（日本MDF?V5410）、真空泵（美国Nulgene EF006）、微量移液器（法国Gilson）、γ?液闪计数仪（西安FJ2003PS）。
1.2 方法
将实验分成6组，每组8个样本。对照组在LEC中加入胎牛血清和DMEM培养液。U?Ⅱ组在对照组的基础上加入终浓度为10?8mol/L的 U?Ⅱ。H7组、PD98059组、W7组和尼卡地平组分别在U?Ⅱ组的基础上加入4种细胞信号转导阻断剂，终浓度分别为H7 10?5mol/L，PD98059 10?5mol/L，W7 10?6mol/L，Nicardipine 10?5mol/L。取第3代培养的LEC并使细胞生长同步化。在CO2培养箱中继续培养12h后，按照上述实验分组，分别加入hU?Ⅱ和 H7，PD98059，W7和尼卡地平。将LEC在CO2培养箱中继续培养12h后，吸去培养液，每孔分别加入3H?TdR（其放射比活性为每孔 3.7×104个/min），继续培养12h。吸去培养液，消化细胞并用真空泵抽滤，将细胞收集于玻璃纤维膜上。于60℃,30min条件下烘干滤膜，用液闪计数仪测定 3H放射活性。
统计学分析：用SPSS 12.0统计软件分析。所有结果用均数± 标准差（ ±s）表示。各组与对照组间数据比较采用t检验，各组间数据比较采用单因素方差One?Way ANOVA分析。
2 结果
U?Ⅱ组LEC的3H掺入放射活性（个/min）显著高于对照组 (2027.4±109.1 vs 1203.8±107.6，P<0.01)，说明U?Ⅱ使LEC发生明显的增殖。4种信号转导阻断剂组的放射活性与U?Ⅱ组比较均有不同程度的降低 (1819.6±47.2，1759.1±169.0，1557.9±71.9，1442.9±192.4，P<0.01, P<0.01)，显示这4组LEC的增殖减少，表明4种阻断剂均不同程度地阻断了U?Ⅱ促进LEC增殖的信号转导途径。在4种阻断剂中，PD98059组和H7 组的放射活性显著低于W7组和Nicardipine组（F=13.251，P<0.01），表明PD98059组和H7 组对U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导途径的阻断作用更强（表1）。表13H?TdR掺入法检测4种信号转导阻断剂对U?Ⅱ诱导LEC增殖的影响 (略)
3 讨论
U?Ⅱ是一种生长抑素样环型结构的神经肽，最早提取自鱼的尾部下垂体，1998年首次从人体克隆出来。研究表明，U?Ⅱ是具有多种生物学效应的新型生物活性物质，具有较强的促进多种细胞增殖的作用。U?Ⅱ可刺激离体培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)发生增殖，呈浓度依赖关系；降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、IL?10等均能抑制由U?Ⅱ诱导的VSMC增殖；U?Ⅱ上调VSMC内皮素基因表达并促进VSMC内皮素的合成释放；肾上腺髓质素可浓度依赖性地抑制U?Ⅱ刺激的VSMC内皮素mRNA水平的增加[4?6]。还有报道U?Ⅱ能促进实验大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞发生增殖，且在一定的浓度范围内其促增殖作用具有浓度依赖性。有关U?Ⅱ促进细胞增殖作用的细胞信号转导机制已有报道[7]，U?Ⅱ促进细胞增殖的途径与Ca2+介导的信号转导通路有密切关系。另有文献指出[8]，抑制与有丝分裂有关的多种信号蛋白分子，如c?src，PKC(protein kinase C)，CaM?PK，MAPK(mitogen activated protein kinase)，钙调神经磷酸酶(CaN)，均可在不同程度上抑制U?Ⅱ的有丝分裂效应，从而抑制U?Ⅱ刺激细胞增殖的作用。Watanabe等[9] 研究发现，PKCCaMGPCRMAPK的阻断剂可抑制U?Ⅱ对VSMC的增殖作用，从而间接表明U?Ⅱ是通过PKCCaMGPCRMAPK信号转导途径发挥其促增殖的作用。
学术论文发表
我们曾发现，眼内各组织中均有一定量的U?Ⅱ，U?Ⅱ能显著促进LEC发生明显的增殖并呈浓度依赖关系。在此基础上，我们采用3H?TdR掺入法检测4种细胞信号转导阻断剂对U?Ⅱ促进LEC增殖的影响，以探讨U?Ⅱ促进LEC 增殖的信号转导机制。这4种信号转导阻断剂中，H7是蛋白激酶C（PKC）抑制剂，PD98059是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂，W7是钙调素（CaM）抑制剂，尼卡地平(Nicardipine)是钙通道阻滞剂。研究结果发现，4种信号转导阻断剂均能降低LEC的放射活性、阻断U?Ⅱ促进 LEC增殖的信号转导通路，使U?Ⅱ促进LEC增殖的作用减弱。间接表明U?Ⅱ是通过DG蛋白激酶C途径、受体酪氨酸蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶途径、 Ca2+和钙调蛋白激酶途径等细胞信号转导途径发挥其促进LEC增殖的作用，从而探明了U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导机制。
白内障囊外摘除联合人工晶状体植入手术后残留的LEC发生增殖，并移行至后囊下形成再生的晶状体结构如珍珠样（Elschnig）小体及 Soemmering环，再向成纤维细胞转化、分泌胶原形成纤维膜, 使晶状体后囊膜发生混浊，导致白内障术后视力再度下降。这是后发性白内障的主要病理生理过程。我们的前期研究发现U?Ⅱ能促进LEC增殖，提出其很可能是后发性白内障的一个重要发生机制。我们的研究结果发现，4种细胞信号转导阻断剂均能阻断U?Ⅱ促进LEC增殖的信号转导通路，使U?Ⅱ促进LEC增殖作用减弱。该结果一方面表明U?Ⅱ促进LEC增殖的作用及其细胞信号转导机制，阐明了后发性白内障发生发展的可能机制；另一方面揭示采用信号转导阻断剂可阻断U?Ⅱ促LEC增殖作用，减少白内障手术后的后囊膜混浊，提出这可能是防治后发性白内障的一个新途径。经广泛查阅国内外文献，有关U?Ⅱ促进晶状体上皮细胞等眼内组织细胞增殖的研究尚未见报道，更未见U?Ⅱ促进LEC增殖作用的细胞信号转导机制的研究报道，本研究具有一定的科学意义和应用前景。
【参考文献】
1 Matsushita M, Shichiri M, Fukai N, et al. Urotensin II is an autocrine/paracrine growth factor for the porcine renal epithelial cell line. Endocrinol 2003;144（5）:1825?1831
2 Maguire JJ, Kue RE, Davenport AP. Ophen?receptor ligand human urotensin II: receptor localization in human tissues and comparison of vasoconstrictor responses with endothelin?1. Br J Pharmacol 2000;131(3):441?446
学术论文发表
3 张勇刚, 陈亚红, 马春艳, 等. 尾加压素的促丝裂作用．中国动脉硬化杂志 2001;9(1):14?16
4 夏春芳,霍勇,尹航, 等. IL?10对尾加压素II诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响．北京大学学报(医学版) 2001;33(4):332?334
5 齐永芬, 夏春芳, 陈亚红, 等. 肾上腺髓质素对尾加压素II刺激的血管平滑肌细胞增殖的影响．中国病理生理杂志 2002;18(3):230?232
6 袁杰,李菊香,李国华,等.降钙素基因相关肽对尾加压素II诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响．贵阳医学院学报 2002；21(3):129?132
7 强正浩, 张孙曦, 李菊香, 等. 钙信号在尾加压素?II促血管平滑肌增殖中的作用．北京大学学报（医学版）2002; 34(3):261?265
8 陈亚红, 赵鸣武, 夏春芳, 等. 尾加压素在大鼠气管平滑肌细胞增殖中的作用及其机制．中华医学杂志 2002;80(12):928?930
9 Watanabe T, Pakala R, Katagiri T, et al. Synergistic effect of urotensin?II with mildly oxidized LDL on DNA synthesis on vascular smooth muscle cells. Circulation 2001;4(1):16?18
