ZFP580基因在高脂血症小鼠主动脉组织中的表达
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发布者：罗玉玉 徐健 孙慧燕 孟祥燕 孔麟麟 张
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时间：2011年1月12日 13:53
【摘要】 目的 探讨ZFP580基因在高脂血症小鼠主动脉组织中的表达情况。方法 将40只C57BL/6小鼠随机分为正常对照组和高脂血症组。采用逆转录PCR方法，检测2组小鼠主动脉组织中ZFP580的表达。结果 ZFP580在两组小鼠的主动脉组织中均有表达，而高脂血症组表达量明显低于对照组（P＜0.01）。结论 血脂升高使ZFP580在C57BL/6小鼠主动脉组织中表达明显下调，表明ZFP580表达改变与高脂血症的发生存在一定关系。
教师发表论文
【关键词】 ZFP580；高脂血症；逆转录PCR；基因表达
【Abstract】 Objective To explore the expression of ZFP580 in aortic tissue of hyperlipidemia mouse and the correlation with levels of plasma lipid. Methods 40 male C57BL/6J mice were randomly divided into 2 groups：control and hyperlipidemia groups. Reverse transcriptase PCR was used to detect mRNA expressions of ZFP580 in aortic tissue. Results ZFP580 was expressed in aortic tissue of the 2 groups. Its expression was down regulated obviously in the hyperlipidemia group.Conclusions The development of hyperlipidemia might be correlated with the variation of ZFP580 expression.
【Key words】 ZFP580；Hyperlipidemia；RT?PCR；Gene expression
近年来，心脑血管疾病发病率居高不下，已经成为威胁人类健康的第一杀手。而高脂血症又是这类疾病的首要危险因素。随着医学研究的深入，从分子水平探讨高脂血症的发病机制，进而寻找新的治疗方法成为当前研究的热点。ZNF580是本课题组以致动脉粥样硬化因素——低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞系ECV304，采用差异显示逆转录——PCR 技术分析，筛选人主动脉cDNA文库，得到的一个全长为1 726 bp的新基因〔1〕。ZFP580为其鼠源性同源基因，其功能可能与高脂血症及动脉粥样硬化的发生有关，但其在高脂血症动物模型各组织中的表达情况尚不明确〔2〕。本实验拟复制高脂血症小鼠模型，并研究ZFP580在小鼠主动脉组织中的表达，为进一步阐明该基因功能奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 动物与主要试剂
近交系雄性8周龄C57BL/6小鼠40只(购自维通利华公司)。DNA 聚合酶、反转录酶等购自大连宝生物公司，RNA 提取试剂盒购自北京鼎国生物技术公司。
教师发表论文
1.2 引物设计与合成
根据GenBank 发表的ZFP580 cDNA序列设计相应的引物。上游引物：5′?ATTAGATCTATGCTGCTGCTGCCGCCGC?3′；下游引物：5′ ?TAACTCGAGTCAGTGCAGGCGCACGTGC?3′，扩增的片段为273 bp。内参照β?actin（540 bp）上游引物5′?GTGGGGCGCCCCAGGCACCA ?3′；下游引物5′?CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC?3′。引物由北京鼎国生物技术公司合成。
1.3 分组及造模
随机分为两组(20只／组)；正常对照组和高脂组。所有动物适应性喂养1 w后，正常对照组在整个过程中用普通饲料喂养；高脂组饲以“西方饮食”(普通饲料+21%脂肪+0.15%胆固醇) 喂养6 w，以饮食诱导形成高脂状态。
1.4 取材及指标检测
1.4.1 血脂测定
摘除眼球取血，2 500 r/min×10 min离心，取血清上样于全自动生化分析仪，检测总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白含量。
1.4.2 组织标本采集
教师发表论文
取血后动物死亡，迅速开胸，剪取小段主动脉组织投入预先装有Trizol的匀浆管中匀浆，按Trizol试剂盒说明书提取小鼠主动脉的总RNA。紫外分光光度计检测RNA纯度及定量。此过程中所用器械、耗材，试剂等均预先进行RNase抑制剂处理。
1.4.3 目的片段的RT?PCR
逆转录合成cDNA：按逆转录试剂盒说明操作，每20 μl反应体系内含有4 μl 25 mmol/L Mgcl2，2 μl 10×逆转录缓冲液，2 μl 10 mmol/L dNTP混合物，0.5 μl RNA酶抑制剂，1 U AMV逆转录酶，0.5 μg Oligo(dT)引物，2.0 μg RNA模板。
以上试剂混合后于42℃反应60 min，然后于99℃加热5 min，灭活酶活性，立即置冰水浴10 min。
用上述逆转录cDNA为模板扩增ZFP580。每25 μl反应体系内含14.5 μl 2×PCR 缓冲液，2 μl 25 mmol/L Mgcl2，2 μl 10 mmol/L dNTP混合物，0.5 μl(2.5 U)Taq DNA 聚合酶,1 μl 25 pmol/L引物，5 μl逆转录产物。PCR反应条件如下：94℃ 3 min;30×(94℃ 45 s,59℃ 45 s,72℃ 1 min );72℃ 10 min。每批模板均同时进行β?actin mRNA的扩增作为内参照。 PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪照相分析。
1.5 统计学分析
用SPSS11.0软件包进行统计分析，两组间比较采用t检验，各指标均用x±s表示。
2 结果
2.1 血脂测定 教师发表论文
高脂组小鼠血脂于饲喂高脂饲料1 w后逐渐升高，2 w后血脂水平基本稳定，继续饲养4 w后，处死动物取血测定总胆固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白水平。两组动物血脂测定结果见表1，高脂组与对照组比较小鼠总胆固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白明显升高（P<0.05）。表1 两组小鼠血脂测定结果（略）
2.2 小鼠主动脉总RNA的提取及RF?PCR结果
见图1，图2。提取的小鼠主动脉总RNA经甲醛变性1%琼脂糖凝胶电泳后可见，28 S、18 S和5 S三条带清晰可见，电泳条带28 S和18 S的亮度比值约为2，证明所提取的总RNA完整无降解。对总RNA进行逆转录和半定量PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。对结果进行凝胶成像分析处理，高脂组小鼠主动脉组织β?actin与ZFP580条带灰度比（0.69±0.11）明显低于对照组β?actin与ZFP580条带灰度比（4.82±1.06），高脂组ZFP580基因表达明显下调（P<0.01）。
3 讨论
高脂血症是诸多心脑血管疾病发生的首要危险因素。近年的研究显示高脂血症的发生除了与机体长期脂质摄入过多导致脂代谢紊乱有关外，还与诸多参与调节脂代谢的基因的异常改变有关。其中有一类基因在调节脂代谢方面的作用逐渐受到人们的关注。它们通常编码含有一组串联重复的锌指结构的蛋白，人们称其为锌指蛋白。研究显示，锌指蛋白通常可作为基因转录的激活子或抑制子，调节基因的转录从而调节体内复杂的生命活动〔3〕。Bouchard等〔4〕确定了一种与脂肪组织内分泌功能有关的锌指基因：ZFP36，并证明它是一种与高脂血症、肥胖等代谢性疾病发生相关的候选基因，可下调肿瘤坏死因子?α的表达。研究表明，另一种与脂质代谢有关的锌指基因ZNF202 mRNA 的表达与两种调节细胞内胆固醇和脂质运输的重要基因ABCA1和ABCG1的表达呈负相关，而ABCA1和ABCG1对维持体内脂质内环境的稳定具有重要作用〔5～7〕。教师发表论文
ZNF580同样属于锌指基因家族的一员。它的cDNA 748～1 266位碱基序列构成一个完整的开放阅读框架，编码172个氨基酸组成的蛋白质。经分子生物学网站进行蛋白质的功能基序分析：其氨基端5?88位氨基酸序列为脯氨酸富含域，羧基端94?172位氨基酸序列中含有三个串联重复的锌指结构域。研究表明：以LDL刺激血管内皮细胞使ZNF580基因表达明显下调，提示其可能参与脂代谢的调节〔2〕。小鼠源性同源基因ZFP580与人ZNF580结构完全一致，故在小鼠高脂模型上研究ZFP580与高脂血症发生的关系必将为进一步揭示人ZNF580的功能提供实验依据〔8〕。
本实验中，C57BL／6小鼠摄入高脂饮食2 w后，产生明显的高脂血症。高脂血症组小鼠的主动脉组织中，ZFP580的基因表达明显低于正常对照组，这可能是机体对于外界损伤因素的一种自我保护。高血脂导致主动脉组织中ZFP580表达下调的机制可能是由于高脂血症时脂质代谢紊乱引起靶细胞膜上某些与脂质代谢有关的信号分子被活化，通过细胞内某种信号转导通路将信息传导到细胞核内，使得核内一系列与脂代谢有关的基因的转录水平发生改变，而ZFP580本身极可能是这种信号通路中的一员，其转录激活或抑制又可影响其下游靶分子的活性，从而形成一个复杂的调控网络。故深入追踪研究与ZFP580相互作用的上下游靶分子及其可能的信号转导通路对于揭示其与高脂血症发生间的关系至关重要。
【参考文献】
1 张文成，陈保生，吴刚，等.低密度脂蛋白降调节新基因cDNA的克隆及结构分析〔J〕.中华医学杂志，2001；81(7)：435?6.
2 张文成，陈保生，吴刚，等.低密度脂蛋白诱导下调的新基因cDNA的克隆及组织表达〔J〕.基础医学与临床，2003；23（3）：279?82.
3 Iuchi S.Three classes of C2H2 zinc finger proteins〔J〕.Cell Mol Life Sci，2001；58(4)：625?35.
4 Bouchard L，Vohl MC，Deshaies Y,et al.Visceral adipose tissue zinc finger protein 36 mRNA levels are correlated with insulin，insulin resistance index，and adiponectinemia in women〔J〕.Eur J Endocrinol，2007；157(4):451?7.
5 Langmann T，Schumacher C，Morham SG,et al.ZNF202 is inversely regulated with its target genes ABCA1 and apoE during macrophage differentiation and foam cell formation〔J〕.J Lipid Res，2003；44(5):968?77.
教师发表论文
6 Stene MC，Frikke?Schmidt R，Nordestgaard BG,et al.Functional promoter variant in zinc finger protein 202 predicts severe atherosclerosis and ischemic heart disease〔J〕.J Am Coll Cardiol，2008；52(5):369?77.
7 Stene MC，Frikke?Schmidt R，Nordestgaard BG,et al.Zinc finger protein 202：a new candidate gene for ischemic heart disease〔J〕. Atherosclerosis，2006；188(1):43?50.
8 孙慧燕，孟祥艳，孔麟麟，等.C57BL/6小鼠ZFP580 C端编码基因的克隆及序列分析〔J〕.武警医学院学报，2008；17（12）:1037?40.
教师发表论文
【关键词】 ZFP580；高脂血症；逆转录PCR；基因表达
【Abstract】 Objective To explore the expression of ZFP580 in aortic tissue of hyperlipidemia mouse and the correlation with levels of plasma lipid. Methods 40 male C57BL/6J mice were randomly divided into 2 groups：control and hyperlipidemia groups. Reverse transcriptase PCR was used to detect mRNA expressions of ZFP580 in aortic tissue. Results ZFP580 was expressed in aortic tissue of the 2 groups. Its expression was down regulated obviously in the hyperlipidemia group.Conclusions The development of hyperlipidemia might be correlated with the variation of ZFP580 expression.
【Key words】 ZFP580；Hyperlipidemia；RT?PCR；Gene expression
近年来，心脑血管疾病发病率居高不下，已经成为威胁人类健康的第一杀手。而高脂血症又是这类疾病的首要危险因素。随着医学研究的深入，从分子水平探讨高脂血症的发病机制，进而寻找新的治疗方法成为当前研究的热点。ZNF580是本课题组以致动脉粥样硬化因素——低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞系ECV304，采用差异显示逆转录——PCR 技术分析，筛选人主动脉cDNA文库，得到的一个全长为1 726 bp的新基因〔1〕。ZFP580为其鼠源性同源基因，其功能可能与高脂血症及动脉粥样硬化的发生有关，但其在高脂血症动物模型各组织中的表达情况尚不明确〔2〕。本实验拟复制高脂血症小鼠模型，并研究ZFP580在小鼠主动脉组织中的表达，为进一步阐明该基因功能奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 动物与主要试剂
近交系雄性8周龄C57BL/6小鼠40只(购自维通利华公司)。DNA 聚合酶、反转录酶等购自大连宝生物公司，RNA 提取试剂盒购自北京鼎国生物技术公司。
教师发表论文
1.2 引物设计与合成
根据GenBank 发表的ZFP580 cDNA序列设计相应的引物。上游引物：5′?ATTAGATCTATGCTGCTGCTGCCGCCGC?3′；下游引物：5′ ?TAACTCGAGTCAGTGCAGGCGCACGTGC?3′，扩增的片段为273 bp。内参照β?actin（540 bp）上游引物5′?GTGGGGCGCCCCAGGCACCA ?3′；下游引物5′?CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC?3′。引物由北京鼎国生物技术公司合成。
1.3 分组及造模
随机分为两组(20只／组)；正常对照组和高脂组。所有动物适应性喂养1 w后，正常对照组在整个过程中用普通饲料喂养；高脂组饲以“西方饮食”(普通饲料+21%脂肪+0.15%胆固醇) 喂养6 w，以饮食诱导形成高脂状态。
1.4 取材及指标检测
1.4.1 血脂测定
摘除眼球取血，2 500 r/min×10 min离心，取血清上样于全自动生化分析仪，检测总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白含量。
1.4.2 组织标本采集
教师发表论文
取血后动物死亡，迅速开胸，剪取小段主动脉组织投入预先装有Trizol的匀浆管中匀浆，按Trizol试剂盒说明书提取小鼠主动脉的总RNA。紫外分光光度计检测RNA纯度及定量。此过程中所用器械、耗材，试剂等均预先进行RNase抑制剂处理。
1.4.3 目的片段的RT?PCR
逆转录合成cDNA：按逆转录试剂盒说明操作，每20 μl反应体系内含有4 μl 25 mmol/L Mgcl2，2 μl 10×逆转录缓冲液，2 μl 10 mmol/L dNTP混合物，0.5 μl RNA酶抑制剂，1 U AMV逆转录酶，0.5 μg Oligo(dT)引物，2.0 μg RNA模板。
以上试剂混合后于42℃反应60 min，然后于99℃加热5 min，灭活酶活性，立即置冰水浴10 min。
用上述逆转录cDNA为模板扩增ZFP580。每25 μl反应体系内含14.5 μl 2×PCR 缓冲液，2 μl 25 mmol/L Mgcl2，2 μl 10 mmol/L dNTP混合物，0.5 μl(2.5 U)Taq DNA 聚合酶,1 μl 25 pmol/L引物，5 μl逆转录产物。PCR反应条件如下：94℃ 3 min;30×(94℃ 45 s,59℃ 45 s,72℃ 1 min );72℃ 10 min。每批模板均同时进行β?actin mRNA的扩增作为内参照。 PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪照相分析。
1.5 统计学分析
用SPSS11.0软件包进行统计分析，两组间比较采用t检验，各指标均用x±s表示。
2 结果
2.1 血脂测定 教师发表论文
高脂组小鼠血脂于饲喂高脂饲料1 w后逐渐升高，2 w后血脂水平基本稳定，继续饲养4 w后，处死动物取血测定总胆固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白水平。两组动物血脂测定结果见表1，高脂组与对照组比较小鼠总胆固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白明显升高（P<0.05）。表1 两组小鼠血脂测定结果（略）
2.2 小鼠主动脉总RNA的提取及RF?PCR结果
见图1，图2。提取的小鼠主动脉总RNA经甲醛变性1%琼脂糖凝胶电泳后可见，28 S、18 S和5 S三条带清晰可见，电泳条带28 S和18 S的亮度比值约为2，证明所提取的总RNA完整无降解。对总RNA进行逆转录和半定量PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。对结果进行凝胶成像分析处理，高脂组小鼠主动脉组织β?actin与ZFP580条带灰度比（0.69±0.11）明显低于对照组β?actin与ZFP580条带灰度比（4.82±1.06），高脂组ZFP580基因表达明显下调（P<0.01）。
3 讨论
高脂血症是诸多心脑血管疾病发生的首要危险因素。近年的研究显示高脂血症的发生除了与机体长期脂质摄入过多导致脂代谢紊乱有关外，还与诸多参与调节脂代谢的基因的异常改变有关。其中有一类基因在调节脂代谢方面的作用逐渐受到人们的关注。它们通常编码含有一组串联重复的锌指结构的蛋白，人们称其为锌指蛋白。研究显示，锌指蛋白通常可作为基因转录的激活子或抑制子，调节基因的转录从而调节体内复杂的生命活动〔3〕。Bouchard等〔4〕确定了一种与脂肪组织内分泌功能有关的锌指基因：ZFP36，并证明它是一种与高脂血症、肥胖等代谢性疾病发生相关的候选基因，可下调肿瘤坏死因子?α的表达。研究表明，另一种与脂质代谢有关的锌指基因ZNF202 mRNA 的表达与两种调节细胞内胆固醇和脂质运输的重要基因ABCA1和ABCG1的表达呈负相关，而ABCA1和ABCG1对维持体内脂质内环境的稳定具有重要作用〔5～7〕。教师发表论文
ZNF580同样属于锌指基因家族的一员。它的cDNA 748～1 266位碱基序列构成一个完整的开放阅读框架，编码172个氨基酸组成的蛋白质。经分子生物学网站进行蛋白质的功能基序分析：其氨基端5?88位氨基酸序列为脯氨酸富含域，羧基端94?172位氨基酸序列中含有三个串联重复的锌指结构域。研究表明：以LDL刺激血管内皮细胞使ZNF580基因表达明显下调，提示其可能参与脂代谢的调节〔2〕。小鼠源性同源基因ZFP580与人ZNF580结构完全一致，故在小鼠高脂模型上研究ZFP580与高脂血症发生的关系必将为进一步揭示人ZNF580的功能提供实验依据〔8〕。
本实验中，C57BL／6小鼠摄入高脂饮食2 w后，产生明显的高脂血症。高脂血症组小鼠的主动脉组织中，ZFP580的基因表达明显低于正常对照组，这可能是机体对于外界损伤因素的一种自我保护。高血脂导致主动脉组织中ZFP580表达下调的机制可能是由于高脂血症时脂质代谢紊乱引起靶细胞膜上某些与脂质代谢有关的信号分子被活化，通过细胞内某种信号转导通路将信息传导到细胞核内，使得核内一系列与脂代谢有关的基因的转录水平发生改变，而ZFP580本身极可能是这种信号通路中的一员，其转录激活或抑制又可影响其下游靶分子的活性，从而形成一个复杂的调控网络。故深入追踪研究与ZFP580相互作用的上下游靶分子及其可能的信号转导通路对于揭示其与高脂血症发生间的关系至关重要。
【参考文献】
1 张文成，陈保生，吴刚，等.低密度脂蛋白降调节新基因cDNA的克隆及结构分析〔J〕.中华医学杂志，2001；81(7)：435?6.
2 张文成，陈保生，吴刚，等.低密度脂蛋白诱导下调的新基因cDNA的克隆及组织表达〔J〕.基础医学与临床，2003；23（3）：279?82.
3 Iuchi S.Three classes of C2H2 zinc finger proteins〔J〕.Cell Mol Life Sci，2001；58(4)：625?35.
4 Bouchard L，Vohl MC，Deshaies Y,et al.Visceral adipose tissue zinc finger protein 36 mRNA levels are correlated with insulin，insulin resistance index，and adiponectinemia in women〔J〕.Eur J Endocrinol，2007；157(4):451?7.
5 Langmann T，Schumacher C，Morham SG,et al.ZNF202 is inversely regulated with its target genes ABCA1 and apoE during macrophage differentiation and foam cell formation〔J〕.J Lipid Res，2003；44(5):968?77.
教师发表论文
6 Stene MC，Frikke?Schmidt R，Nordestgaard BG,et al.Functional promoter variant in zinc finger protein 202 predicts severe atherosclerosis and ischemic heart disease〔J〕.J Am Coll Cardiol，2008；52(5):369?77.
7 Stene MC，Frikke?Schmidt R，Nordestgaard BG,et al.Zinc finger protein 202：a new candidate gene for ischemic heart disease〔J〕. Atherosclerosis，2006；188(1):43?50.
8 孙慧燕，孟祥艳，孔麟麟，等.C57BL/6小鼠ZFP580 C端编码基因的克隆及序列分析〔J〕.武警医学院学报，2008；17（12）:1037?40.
